ZEB2基因3′UTR区转染对人胃黏膜上皮细胞GES-1增殖、侵袭、迁移的影响*

李素丽 周 芳 张庆瑜△ 贾文亮 张安玲 韩 磊 康春生

microRNA（miRNA）是长约22 nt的短链RNA，可与miRNA反应元件（miRNA response elements，MREs）互补结合，结合后能够通过促进靶mRNA的降解和（或）抑制其翻译而负性调控基因的表达。人们对miRNA-mRNA已有足够的认识，但关于mRNA-miRNA反向作用却知之甚少。已证实MREs能够作用于miRNAs，从而调节后者的作用[1-2]。Tay等[3]证实肿瘤抑制因子PTEN假基因（PTENP1）的3′非翻译区（UTR）能与PTEN结合相同的miRNA，以miRNA依赖的方式调控细胞PTEN和P-Akt蛋白水平。miR-200a/b/c在胃癌中低表达，通过抑制E盒结合锌指蛋白（ZEB）的表达，调节肿瘤的发生发展[4-5]。因此，本研究应用人工合成ZEB2 3′UTR转染人胃黏膜上皮细胞GES-1，研究其对miR-200家族的调节作用，观察并分析其对GES-1的影响，旨在从其增殖、迁移、侵袭力方面探讨ZEB2 3′UTR导致正常胃黏膜上皮细胞恶性转化的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ZEB2 3′UTR质粒由南京金斯瑞公司合成；QIAGEN质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司,Trizol试剂及转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，ZEB1、ZEB2单克隆抗体购自美国Abcam公司，基质金属蛋白酶（MMP）-2/9、增殖细胞核抗原（PCNA）及相应二抗均购自中杉金桥公司；dNTP mixture、反转录酶（MMLV）、RNase抑制剂购自大连Takara公司，逆转录引物及qRT-PCR引物、荧光定量miRNA PCR试剂盒、miR-200b micmics购自上海吉玛制药技术有限公司；matrigel购自美国BD公司；GES-1由天津医科大学神经肿瘤研究所馈赠。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建与提取 利用GenBank数据库检索ZEB2基因序列（Gen Bank,NM_001171653.1,NM_014795.3）找出其3′UTR含miR-200家族的结合序列全长，选用PGL3-Control表达载体。将序列交由南京金斯瑞公司合成，见图1。根据QIAGEN质粒中提试剂盒说明书进行质粒的提取与纯化。

1.2.2 细胞培养与分组处理 GES-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于含5%CO2，37℃的恒温培养箱中培养。第一部分：检测ZEB2 3′UTR转染后对ZEB1/ZEB2 mRNA、蛋白水平及miR-200a/b/c的影响；实验分为对照组、突变组和ZEB2 3′UTR组。第二部分：验证miR-200b在ZEB2 3′UTR转染后调节增殖、侵袭、迁移中的作用；实验分为对照组、ZEB2 3′UTR组、ZEB2 3′UTR+无义序列组、ZEB2 3′UTR组+miR-200b micmics组。根据Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染，继续处理细胞48 h后进行下一步实验。

1.2.3 qRT-PCR检测细胞miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2的表达变化 Trizol法提取待测细胞总RNA，按试剂盒说明书应用ZEB1、ZEB2、miR-200a/b/c特异性逆转录、PCR引物及相应组分配置反应体系。microRNA逆转录条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min。所得逆转录产物cDNA行qRTPCR检测各组miR-200a/b/c的表达水平，反应条件：95℃10 min；95℃15 s，65℃30 s，72℃30 s；共40个循环。ZEB1、ZEB2 cDNA模板合成条件：42℃1 h。PCR扩增，其特异性引物序列，见表1。扩增条件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40个循环；72℃延伸5 min。分别以U6、GAPDH作为内参，结果判定采用2－ΔΔCT法。

Figure 1 Schematic representation of the ZEB2 3′UTR plasmid constructs图1 ZEB2 3′UTRs区质粒构建示意图

Table 1 The qRT-PCR primers sequences of ZEB1/ZEB2/GAPDH表1ZEB1、ZEB2、GAPDH qRT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot检测细胞蛋白表达水平 用细胞裂解液RIPA裂解提取待测细胞的总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒压80 V电转移至PVDF印迹膜。膜封闭液封闭1 h后，加入一抗ZEB1、ZEB2、MMP2/9、PCNA、GAPDH（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000稀释），室温孵育1 h，凝胶成像系统采集成像。GAPDH蛋白作为内参。以目标蛋白条带灰度值/同一样本内参条带灰度值计算目标蛋白相对表达量。

1.2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力 在Transwell上室聚碳酸酯滤膜（孔径8 μm）上加入预冷无血清DMEM培养基稀释的Matrigel基质胶（Matrigel∶DMEM=1∶2）100 μL，37℃30 min后待其凝固，接种100 μL无血清培养基稀释GES-1细胞（1×106个/mL），下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，每组设3个复孔。37℃、5%CO2条件下培养24 h后，弃去上室液体，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，苏木精染色。DP-70荧光相差倒置显微镜（×100）采集图像，随机读取3个视野，计算穿过膜的细胞数。

1.2.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 将已转染的细胞放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。次日用200 μL微量移液枪头在6孔板内垂直及平行划痕，PBS液洗涤2次后加入无血清培养基，在倒置显微镜下观察0、48 h后划痕两侧细胞的迁移情况并拍照。距离差除以2为细胞相对迁移距离，计算细胞相对迁移率（相对迁移率=相对迁移距离/0 h时划痕边缘距划痕中线距离），重复3次并进行统计分析。

1.2.7 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞，常规胰酶消化制成单细胞悬液，细胞以4×103个/孔接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL培养基，5%CO2、37℃培养箱内培养24 h后转染。取3组细胞测其吸光度（A）值，每组3个复孔，每24 h测1次。测时每孔加入20 μL（5 g/L）MTT，温育4 h后，弃去培养基，加入200 μL DMSO，振荡10 min。在酶标仪上测490 nm处各孔的A值，计算生长增殖率=（实验组A490值/对照组A490值－1）×100%。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，3组及以上数据间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染ZEB2 3′UTR对GES-1细胞miR-200a/b/c及ZEB1、ZEB2 mRNA表达水平的影响 结果显示，转染ZEB2 3′UTR后，GES-1细胞中miR-200a/b/c表达水平较对照组及突变组明显下降，以miR200b下调最为显著（均P＜0.01），突变组较对照组无明显改变，见图2。ZEB1及ZEB2 mRNA表达水平较对照组及突变组明显上升（均P＜0.01），见图3。

2.2 Western blot检测转染ZEB2 3′UTR后ZEB1/ ZEB2蛋白表达变化 转染ZEB2 3′UTR后，GES-1细胞中ZEB1和ZEB2蛋白相对表达水平较对照组、突变组明显升高（P＜0.01），见图4、表2。

2.3 转染ZEB2 3′UTR及恢复miR-200b micmics表达后对细胞侵袭、迁移能力的影响 ZEB2 3′UTR+ miR-200b micmics组miR-200b的表达水平高于其他3组，见图5。Transwell体外侵袭实验检测转染后穿过微孔的平均细胞数目，结果显示，ZEB2 3′UTR组较对照组均明显升高，而联合miR-200b micmics后，穿过小室的细胞数较ZEB2 3′UTR组明显减少（均P＜0.01），见图6、表3。划痕实验结果显示，48 h后ZEB2 3′UTR组细胞运动速度明显快于对照组，迁移率显著升高，而恢复miR-200b表达后，其迁移能力有所下降（P＜0.01），见图6、表3。且MMP2/9侵袭指标也出现相应变化，见图7、表4。

Figure 2 Comparison of miR-200a/b/c expression levels between three groups图2 各组细胞的miR-200a/b/c表达水平比较（n=3）

Figure 3 Comparison of ZEB1 and ZEB2 expression levels between three groups图3 各组细胞的ZEB1、ZEB2表达水平比较（n=3）

Figure 4 The protein expression levels of ZEB1/ZEB2 in three groups图4 3组细胞内ZEB1/ZEB2蛋白表达水平

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各组细胞中ZEB1/ZEB2蛋白表达水平比较（n=3，±s）

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各组细胞中ZEB1/ZEB2蛋白表达水平比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与突变组比较，P＜0.05

组别对照组（1）突变组（2）ZEB2 3′UTR组（3）F ZEB1相对表达量0.23±0.02 0.22±0.01 0.41±0.07ab 35.344＊＊ZEB2相对表达量0.10±0.03 0.10±0.07 0.19±0.02ab 40.700＊＊

Figure 5 The expression levels of miR-200b evaluated by qRT-PCR in four groups图5 qRT-PCR检测不同处理组miR-200b的表达水平

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4组转染后细胞侵袭能力及细胞迁移率比较（n=3，±s）

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4组转染后细胞侵袭能力及细胞迁移率比较（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a与（1）组比较，b与（2）组比较，c与（3）组比较，P＜0.01；表4同

组别对照组（1）ZEB2 3′UTR组（2）ZEB2 3′UTR+无义序列组（3）ZEB2 3′UTR+200b micmics组（4）F穿膜细胞数（个）45.67±3.21 76.33±3.78a 77.33±2.51a 47.33±3.79bc 81.353＊＊48 h迁移率（%）24.91±2.56 52.45±2.63a 54.01±3.10a 26.33±3.02bc 94.602＊＊

2.4 MTT检测转染后细胞增殖活性 4组之间A490值于第1天差异无统计学意义（F=0.995，P＞0.05），第2～6天差异均有统计学意义（F分别为8.630、18.377、11.925、24.545、35.058，均 P＜0.01）；且ZEB2 3′UTR组A490值于第2～6天较对照组及ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics组显著升高（均P＜0.01）；而ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics组A490值于第1～6天和对照组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图8。相应反映增殖能力指标的PCNA蛋白与生长曲线一致，出现相应变化，见图7、表4。

Figure 6 Comparison of trans-membrane cell numbers and migrating rates between four groups（×100）图6 4组细胞中穿过小室细胞数及迁移率比较（×100）

Figure 7 The protein expression levels of MMP2/9 and PCNA in four grouops图74组细胞内MMP2/9及PCNA蛋白表达水平

Figure 8 The growth curves of GES-1 in different groups图8 不同处理组GES-1细胞的生长曲线

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各组细胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表达水平比较（n=3，±s）

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各组细胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表达水平比较（n=3，±s）

组别对照组（1）ZEB2 3′UTR组（2）ZEB2 3′UTR+无义序列组（3）ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics组（4）F MMP2 0.28±0.02 0.53±0.01a 0.55±0.05a MMP9 0.36±0.03 0.69±0.03a 0.67±0.04a PCNA 0.63±0.03 1.03±0.05a 1.01±0.06a 0.30±0.03bc 77.993＊＊0.39±0.02bc 107.487＊＊0.66±0.02bc 69.147＊＊

3 讨论

3.1 mRNA-miRNA反向作用的机制 近期提出的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceR⁃NA）假说认为：mRNA、被转录的假基因和长的非编码RNA之间能够通过竞争miRNA的方式进行交互对话，这种作用依赖于“MREs”[6]。RNA之间通过竞争性结合相应的miRNA，对该miRNA的后续转录后调控作用发生有效的控制。Sumazin等[7]绘制出了恶性胶质瘤细胞中RNA相互作用网络，有超过7 000种基因编码RNA以借助miRNA的方式发生了相互作用，与癌症相关的基因起着重要的调控作用，从而参与肿瘤的发生发展过程。

3.2 3′UTR在肿瘤发生发展过程中的调节作用 PTENP1的3′UTR及PTEN ceRNA ZEB2能与PTEN结合相同的miRNA，以miRNA依赖的方式调控细胞内PTEN和P-Akt蛋白水平；其缺失可致PI3K/AKT信号激活，诱导肿瘤发生[3,8]。外源性表达“miRNA海绵”能够有效特异地抑制miRNA的功能[9]。含MREs的3′UTR具有强大的生物学活性，成为miRNA“诱饵”，螯合miRNA，从而影响它们对所表达的基因的调控。本研究中转染ZEB2 3′UTR后，ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平均升高，可能与上述机制有关。

3.3 ZEB2 3′UTR对细胞恶性转化的影响及可能机制 本研究转染ZEB2 3′UTR质粒后，miR-200a/b/c表达下调，以miR-200b降低最为明显，此变化可能与2种因素有关：一方面，特异的miRNA结合位点结构与miRNA结合后触发miRNA加尾和3′→5′修剪及亚细胞定位而影响miRNA的稳定性有关[10-11]；另一方面，ZEB1/ZEB2能结合miR-200b/200a/429启动子区以调节其表达[12]，ZEB2 3′UTR的导入引起miR-200家族表达降低，进而减弱其对ZEB1/ZEB2的抑制作用，升高的ZEB1/ZEB2则进一步加强了其对miR-200家族成员的表达抑制作用，形成一个正反馈调节作用。恢复miR-200b表达后，细胞恶性转化能力部分被逆转，ZEB2 3′UTR对miR-200b的调控可能是其发挥作用的主要机制之一。

ZEB2 3′UTR可以促进人胃黏膜上皮细胞的恶性转化倾向，此作用可能与转染ZEB2 3′UTR后调控miR-200家族进而影响相应的靶基因ZEB1/ZEB2的表达有关。本研究证实了非编码转录在基因规模上的影响，有望为抑制GES-1细胞恶性转化提供新的途径或方法。

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