高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量

程利娟，郭 琪，雷 虹，杨 莹，申 睿，慕 磊，王彦宗

高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量

程利娟，郭 琪，雷 虹，杨 莹，申 睿，慕 磊，王彦宗

目的采用高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量。方法 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(4．6 mm ×250mm，5 μm)，流动相:乙腈 －0．01mol/L 磷酸二氢钾溶液(6∶94)，流速:1．0 ml/min，检测波长:260 nm，柱温:30℃，进样量:10μl。结果 腺苷在2．696～67．40 g/ml范围内与其峰面积呈现良好的线性关系(r=0．999 9)，平均回收率为99．89%，相对标准偏差为1．71%(n=6)。结论 该方法简便准确，灵敏度高，重复性好，为控制牛樟芝的质量提供了科学依据。

牛樟芝;腺苷;色谱法，高效液相

牛樟芝(Antrodiacamphorata)又名牛樟菇、樟菇、樟芝、阴阳对口菇、灵芝之王、血灵芝、棺花，为台湾地区特有真菌品种，具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗细菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等生理活性，而且不良反应很少［1-2］。现代科学研究表明，牛樟芝含有三萜类化合物、多糖、腺苷、超氧歧化酶、有机锗、蛋白质(含免疫蛋白)、维生素、烟碱酸、麦角固醇等多种有效成分［3］。腺苷作为牛樟芝重要活性成分之一，能够降低体外循环后肺缺血－再灌注损伤，有效改善右心功能，对再灌注心脏具有保护作用，同时提高血液供氧能力和加速血液微循环，提高血液对心脑的供氧能力［4-8］，是牛樟芝发挥药理作用的主要成分之一，但目前尚未见以腺苷作为牛樟芝内在质量评价指标的相关报道。为了进一步严格控制中药材的质量，确保临床用药的有效性，本实验采用高效液相色谱法测定牛樟芝中腺苷的含量，以期为牛樟芝的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪(包括四元泵，VWD检测器，自动进样器，ChemStation化学工作站);Mettler-Toledo AX205电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);KQ-300VDB型双频数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

腺苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110879-200202)，牛樟芝药材(宏潮生物健康科技推广中心，批号:20121025，20121208，20130125)，甲醇、磷酸二氢钾、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4．6 mm × 250 mm，5 μm)，流 动 相:乙 腈 －0．01 mol/L磷酸二氢钾溶液 (6∶94)，流速:1．0 ml/min，检测波长:260 nm，柱温:30℃，进样量:10 μl。

图1 腺苷(A)和牛樟芝样品(B)的高效液相色谱图

2.2 系统适应性试验 在上述色谱条件下，腺苷色谱峰的理论塔板数＞10 000，分离度为2．95，拖尾因子为0．97，色谱图见图1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液制备:精密称取腺苷对照品13.48 mg，加15%甲醇定容至100 ml，制成浓度为134.8μg/m l的对照品储备液，置4 C冰箱保存。

2.3.2 供试品溶液制备:取牛樟芝粉末(过三号筛)1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15%甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用15%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 精密量取腺苷对照品储备液0.2、1.0、2.0、3.0、5.0 ml分别置于 10 ml量瓶中，加15%甲醇定容，摇匀，制成浓度分别为2.696、13.48、26.96、40.44、67.40 μg/ml的标准品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程:Y=32.499X+0.1498(r=0.999 9，n=6)，表明腺苷在2.696～67.40μg/ml范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取浓度为40.44μg/ml的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.58%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，结果腺苷峰面积的RSD为0.99%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批样品6份，按“2.3.2”项下方法制成供试品溶液，进样测定，结果样品中腺苷平均含量为1.18 mg/g，RSD为0.93%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率测定 精密称取6份已知含量(1.18 mg/g)的牛樟芝样品(批号20121025)0.1 g，分别精密加入40.44μg/ml的腺苷对照品溶液3.0 ml，按“2.3.2”项下方法制成供试品溶液，测定腺苷含量，计算回收率，结果见表1。

表1 牛樟芝样品腺苷含量及回收率测定结果(n=6)

2.9 样品含量测定 按“2．3．2”项下方法制备供试品溶液，按“2．1”项下色谱条件测定3批样品的含量，每份样品平行测定3份，结果腺苷的含量分别为 1．18、1．27、1．21 mg/g，RSD 分别为 0．97%、1.27%、1．14%。

3 讨论

3.1 流动相的选择 采用高效液相色谱法测定腺苷含量的报道较多，以甲醇－磷酸二氢钾体系较多见，但是分析时间较长［9-18］。参考其他文献，发现乙腈－磷酸二氢钾体系也常用于腺苷含量的测定［19-23］。研究比较发现，乙腈－磷酸二氢钾溶液作为流动相体系的基线较甲醇－磷酸二氢钾体系稳定，通过比较乙腈－0．01 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈 －0．02 mol/L磷酸二氢钾溶液、乙腈 －0．05 mol/L磷酸二氢钾溶液等多种流动相体系，发现乙腈－0．01 mol/L磷酸二氢钾溶液效果最好，而高比例磷酸盐的存在可能对泵和色谱柱造成损害［24］。

3.2 色谱柱的选择 通过对Agilent Zorbax SB-C18，Agilent Zorbax SB-C8，Agilent Eclipse XDB-C18多个不同填料色谱柱用于腺苷的分离效果进行比较，发现腺苷在Agilent Zorbax SB-C18色谱柱的分离效果最好，故选择Agilent Zorbax SB-C18开展试验。

3.3 提取溶剂的选择 通过比较甲醇、45%甲醇、15%甲醇、水4种不同提取溶剂对试验的影响发现，提取溶剂为15%甲醇时，腺苷的提取量较高，色谱图中杂质峰的影响较小，可能是由于牛樟芝中含有大量多糖成分，在使用甲醇处理时多糖和其他大分子物质发生沉淀，情况得到改善，因此，选择15%甲醇为提取溶剂。

人工栽培牛樟芝药用价值较高，但价格昂贵，因此通过测定有效成分的含量，对培养条件、培养方式进行优化显得尤为重要，可进一步保证和提高牛樟芝产品的质量。

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High Performance Liquid Chromatography in Determ ination of Adenosine Content in Antrodia Cam phorata

CHENG Li-juan1，2，GUO Qi2，LEIHong2，YANG Ying2，SHEN Rui2，MU Lei2，WANG Yan-zong2(1．Department of Pharmacology，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei075000，China;2．Institute for Drug and Instrument Control，Combined Logistics Department of Beijing Military Area Command，Beijing 100071，China)

ObjectiveTo detect the Adenosine content in Antrodia Camphorata using high performance liquid chromatography(HPLC)．MethodsThe chromatographic column was Agilent Zorbax SB －C18column(4．6 mm ×250 mm，5 μm);the mobile phase was acetonitrile－0．01 mol·L－1KH2PO4solution(6∶94);the flow rate was 1．0 m l/min－1;the detection wavelengthwas260 nm;the column temperaturewas setat30 ℃;the injection volumewas 10 μl．ResultsA good linear relationship between the peak area and Adenosine concentration was observed within the range of 2．696 －67．40mg/ml(r=0．9999)．The average recoverywas99．89%with 1．71%of relative standard deviation(n=6)．ConclusionThismethod is accurate and has good sensitivity and reproducibility，and can provide scientific basis for controlling the quality of Antrodia camphorata．

Antrodia camphorata;Adenosine;Chromatography，high performance liquid

R927．11

A

2095-140X(2014)05-0076-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．021

军队中医药科研专项课题(10ZYZ204)

075000河北张家口，河北北方学院药理教研室(程利娟);100071北京，北京军区联勤部药品仪器检验所(程利娟、郭琪、雷虹、杨莹、申睿、慕磊、王彦宗)

王彦宗，E-mail:13701081036@139．com

2013-12-20 修回时间:2014-01-15)

·论著·