携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

罗 芸，张新宇，万东君，刘晓花，付学锋

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

罗 芸，张新宇，万东君，刘晓花，付学锋

目的构建单纯LIM蛋白3(LMO3)的逆转录表达载体，并观察其在NIH/3T3细胞中的表达情况。方法 重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后，脂质体法转染到pA317包装细胞，G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3，并对其进行病毒滴度检测，NIH/3T3细胞分为3组:以pLXSN-LMO3转染为实验组，以pLXSN转染为阴性对照组，正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹(Western blot)法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果 重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确，其病毒滴度平均可达4.04×106cfu/ml，各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达，其中实验组高表达LMO3，与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体，并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白，为下一步开展基因治疗奠定了基础。

单纯LIM蛋白3;NIH/3T3细胞;逆转录病毒科感染;pLXSN

LIM蛋白是一类富含半胱氨酸且有一个或多个锌指结构的蛋白家族，含有一段高度保守氨基酸序列 CX2CX17-19HX2CX2CX16-20CX2C/H/D，即 LIM结构域［1］。单纯LIM蛋白(LIM domain only，LMO)有N末端两个串联的LIM结构域和C末端其他序列组成，因无DNA结合的同源结构域，必须与其他多种转录调控分子结合形成复合物，在机体的分化和发育过程中发挥重要作用［2］。本实验构建了LMO3的逆转录表达载体，筛选出稳定的产毒细胞株，并且通过感染NIH/3T3细胞，用免疫组化染色及蛋白印迹(Western blot)法检测其蛋白表达情况，为下一步开展基因治疗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 限制性内切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA连接酶及其他各种工具酶均购自TaKaRa公司;Taq Plus IDNA聚合酶、dNTPS购自上海生工生物公司;LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNA提取试剂盒购自安徽优晶生化工程有限公司;DMEM/F12培养基、G418购自Gibco公司;胎牛血清为杭州四季青公司产品;菌株E.coil DH5α、质粒pEGFP-cl-LMO3、逆转录病毒载体 pLXSN、兔抗人LMO3多克隆抗体、pA317细胞株和NIH/3T3细胞株均为笔者所在实验室保存。兔抗β-Actin单克隆抗体、羊抗兔IgG/TRITC为上海中山生物公司产品。LMO3的引物合成及基因测序均由上海生工生物公司完成。上游引物5＇-TAGAATTCTATGCTCTCAGTTCAGCCAG-3＇(EcoR I);下游引物 5＇-TAGGATCCGATGTAGTGCTTTGCATTGTTGG-3＇(BamH I)。HF90型CO2恒温培养箱为上海力申公司产品;IX71型荧光倒置生物显微镜为日本Olympus公司产品;D77型凝胶成像分析系统为英国UVITEC公司产品;ChemiDoc型化学发光成像系统为美国UVP公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 携带LMO3基因的逆转录病毒载体的构建:质粒pEGFP-cl-LMO3及逆转录病毒载体质粒pLXSN，经EcoR I及BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。将双酶切后的LMO3片段和pLXSN载体按2∶1混合后，用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化E.coil DH5α感受态细菌，涂匀于氨苄西林抗性LB平板，37℃培养过夜。挑取克隆菌落，扩增并提取质粒，对质粒分别进行 EcoR I及BamH I双酶切和PCR鉴定，LMO3酶切片段委托上海生工生物公司进行测序。

1.2.2 逆转录病毒载体的包装和稳定转染:取pA317对数生长期细胞，按1×105个/孔接种于24孔培养板中，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书方法，NIH/3T3细胞为空白对照组，将重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3(实验组)和阴性对照载体pLXSN(阴性对照组)转染至pA317包装细胞。无血清、无双抗的DMEM培养基37℃、50 m l/L CO2培养4 h，更换含100 ml/L胎牛血清的完全培养基继续培养。24 h后传代并以0.9 g/L浓度的G418进行抗性筛选，每3 d换液1次。连续培养2周后，大量非转染细胞死亡，更换为含0.4 g/L G418的培养基继续抗性稳定筛选，直至克隆出现。采用有限稀释法培养至单克隆出现后，进行扩增稳定传代。当转染的pA317细胞融合达80%左右时，更换无G418培养基继续培养24 h后，回收培养上清，0.45μm低蛋白吸附，醋酸纤维滤膜过滤，获得逆转录病毒上清，-70℃储存备用。

1.2.3 逆转录病毒上清病毒滴度测定:在24孔培养板中，按照1×105个/孔接种NIH/3T3细胞(空白对照组)及以pLXSN-LMO3、pLXSN转染的NIH/3T3细胞(实验组、阴性对照组)，100 ml/L胎牛血清的DMEM中培养1 d。更换为无血清、无双抗的DMEM 培养基，分别按照加入 10、102、103、104、105、106倍稀释的病毒上清及阴性对照上清100μl，最后各加入终浓度为4 mg/L Polybrene。37℃、50 ml/L CO2培养24 h，胰酶消化细胞，按照1∶20稀释传代，继续培养2 d后，加入200 mg/L G418继续筛选2周。观察克隆形成情况，最后40 g/L多聚甲醛固定，Giemsa染色，对抗性细胞克隆数计数，以计算病毒滴度，单位以cfu/ml表示。

1.2.4 免疫组化染色检测NIH/3T3细胞中LMO3的表达:将 NIH/3T3细胞(空白对照组)及感染pLXSN-LMO3、pLXSN的 NIH/3T3细胞(实验组、阴性对照组)胰酶消化后，在多聚赖氨酸预处理过的盖玻片上爬片生长24 h。以预冷40 g/L多聚甲醛固定液固定 5 min，室温晾干。PBS漂洗3次，5 min/次。封闭液(10 g/L BSA+4 ml/L Triton X-100)37℃封闭30 min。加入1∶400稀释的兔抗人LMO3多克隆抗体37℃孵育2 h。PBS漂洗，加入1∶400稀释的羊抗兔-TRITC抗体37℃孵育3 h。PBS漂洗，700 ml/L甘油封片，荧光显微镜观察、拍照。

1.2.5 Western blot法检测NIH/3T3细胞中LMO3的表达:以pLXSN-LMO3转染的NIH/3T3细胞为实验组，pLXSN转染的细胞为阴性对照组，NIH/3T3细胞为空白对照组。细胞培养48 h后，胰酶消化收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA裂解液，冰水浴中裂解30 min。用BCA法对样品蛋白定量，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离。300 mA电转1 h，将蛋白转移至 NC膜，脱脂奶粉封闭过夜。TBST清洗3次，5 min/次。分别加入1∶400稀释的兔抗人LMO3多克隆抗体和β-actin抗体，37℃孵育2 h。TBST清洗，加入1∶500稀释的羊抗兔-HRP抗体，4℃过夜。TBST清洗后，滴加ECL化学发光试剂，ChemiDoc型化学发光成像系统成像并进行灰度值分析。

2 结果

2.1 逆转录表达载体构建及PCR鉴定 对重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经EcoR I及BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳，拍照后观察，获得了大小约为478 bp的目的条带;以重组质粒为模板，进行PCR扩增，同样获得了大小约为478 bp的阳性目的片段，与引物设计的LMO3大小一致(图1)。经进一步测序证实基因序列完全正确(GenBank登录号:AF258348)，测序结果未显示。

图2 稳定转染pA317细胞系建立

2.2 稳定转染逆转录病毒pA317细胞的建立 脂质体转染pA317包装细胞后，加入0.9 g/L G418进行抗性筛选，1周后3组细胞均开始出现死亡。2周后，空白对照组细胞基本全部死亡，阴性对照组、实验组均有少量细胞存活，并形成小克隆，更换G418浓度为0.4 g/L进行稳定筛选，继续培养3周后形成多个明显的克隆，见图2。挑取细胞克隆，有限稀释于96孔板，继续加入0.4 g/L的G418培养，待形成单克隆后，进行扩增培养并稳定传代。

图1 重组质粒pLXSN-LMO3鉴定

2.3 逆转录病毒滴度的测定 转染后的pA317细胞经G418稳定筛选后阴性对照组、实验组分别获得了11个和23个较大的单克隆。有7株pLXSNLMO3和3株pLXSN为高产毒株。实验组病毒滴度为(4.04±1.87)×106cfu/ml，阴性对照组病毒滴度为(6.81±2.11)×106cfu/ml。

2.4 免疫组化染色检测 NIH/3T3细胞中LMO3的表达，镜下观察发现:实验组可见明显的强红色荧光，主要集中在细胞核内，在核周亦见少量的分泌表达;而阴性对照组及空白对照组仅有极个别细胞可见到极弱荧光，且荧光分布在整个细胞内，应为荧光染料非特异性染色所致。见图3。

图3 感染后NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色(TRITC×200)空白对照组、阴性对照组、实验组为NIH/3T3细胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3转染的NIH/3T3细胞

2.5 Western blot法检测NIH/3T3细胞中LMO3的表达情况 3组均可见大小约为18 kD的单一蛋白免疫反应条带，与文献报道的LMO3蛋白分子大小一致，见图4。以β-actin为内参照，通过成像分析软件分析3组LMO3的相对于β-actin的表达量，实验组(1.100±0.082)相对于阴性对照组(0.093±0.005)和空白对照组(0.104±0.008)高表达LMO3蛋白，差异均有统计学意义(P＜0.05)，阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图4 Westernblot法检测感染pLXSN-LMO3病毒NIH/3T3细胞LMO3的表达空白对照组、阴性对照组、实验组为NIH/3T3细胞及以pLXSN、pLXSN-LMO3转染的NIH/3T3细胞

3 讨论

LMO为LIM蛋白家族成员，该类蛋白是一种蛋白相互作用的适配器，其LIM结构域在不同组织、器官及生物的不同发育时期可与核内广泛分布的LIM结构域结合蛋白(Ldb)及其他的转录调节因子结合形成转录复合体，进而调控特定的下游靶基因的表达［3-5］。LMO蛋白家族成员包括 LMO1～4，在胚胎的神经系统形成、脑发育和红细胞的生成等过程中担当重要角色，并且与成神经细胞瘤等肿瘤的发生和发展密切相关［6］。LMO1和LMO2最早发现于急性T细胞白血病(T-ALL)时，被转位至染色体上T细胞受体位点，是T细胞癌蛋白［7-8］。LMO4特异性分布在乳腺中，主要作用是抑制乳腺表皮细胞的分化，与乳腺癌的发生、增殖以及预后都有密切的关系［9-11］。LMO3主要广泛存在于脑、脊髓腹侧、三叉神经元、视网膜等组织中，主要调控中枢神经系统细胞的发育和分化，同时参与成神经细胞瘤等肿瘤的形成和转录调控［12-17］，但是关于LMO3更多的生物学功能有待进一步的研究。

逆转录病毒载体系统是目前应用最广泛的基因转移系统，逆转录病毒具有相当高的感染效率，分裂期的靶细胞几乎可以100%地被转染，且外源性基因可以整合到靶细胞染色体中，在靶细胞内稳定表达。该系统具有寄主广泛、导入基因拷贝数多、免疫原性较低、转染效率高、外源基因表达稳定等优点［18］。

本研究中选取的逆转录病毒载体pLXSN是由Miller等在逆转录病毒载体N2基础上构建的新一代载体，获美国FDA临床试验许可证［19-20］。采用直接连接方式构建重组病毒，不需进行空斑化，避免了阴性重组病毒，提高了重组效率。含有多个克隆位点，降低了同源重组的概率，使基因转移隐患降低，具有较高的安全性。在构建过程中，其导入的外源基因上游含有启动子，下游连接终止密码子，可形成完整而稳定的表达框，既可经过包装后瞬时表达，产生较高滴度的重组病毒颗粒，同时又因带有Neo基因，在G418稳定筛选的作用下，感染细胞可以持久存活并且持续表达外源目的基因蛋白，而且因其不表达任何具有免疫原性的病毒蛋白，所以引起机体的免疫反应低［21］。

本实验成功构建了重组逆转录表达载体pLXSN-LMO3，PCR和双酶切鉴定其目的基因LMO3导入正确，经测序检测基因序列未见有插入、重排、缺失等突变。通过脂质体转染成功导入了包装细胞系pA317，经G418长时间稳定筛选获得了多株稳定表达的单克隆高产毒细胞株，其病毒平均滴度为4.04×106cfu/ml，最高滴度为 1.24 ×107cfu/ml。重组逆转录表达载体pLXSN-LMO3构建正确，且成功感染NIH/3T3细胞，免疫荧光组化染色观察，可在靶细胞核内合成、表达及分泌LMO3蛋白。Western blot实验进一步证实了感染的靶细胞高表达LMO3蛋白，与阴性对照组和空白对照组比较差异显著。

综上所述，本实验得到了稳定感染逆转录病毒载体介导的LMO3的NIH/3T3细胞，并且对表达产物LMO3进行了检测，为下一步研究LMO3的生物学功能、肿瘤细胞体外实验及其基因治疗等方面奠定了基础。

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Construction of Recombinant Retroviral Vector Carrying LMO3 Gene and Its Expression in NIH/3T3 Cells

LUO Yun，ZHANG Xin-yu，WAN Dong-jun，LIU Xiao-hua，FU Xue-feng(Departmentof CadreWards，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo construct recombinant retroviral vector carrying LIM domain only 3(LMO3)gene and study its expression in NIH/3T3 cells.MethodsThe retroviral vector pLXSN-LMO3 was identified by restriction enzyme analysis and DNA sequencing analysis，and then was transfected into retrovirus packaging cell line pA317，and G418 was used to select stable virus-producing cell lines.The recombinant retroviruswas used to infect NIH/3T3 cells in vitro，and the value of viral titerwas determined.The NIH/3T3 cellswere divided into three groups:experimental group(infected with the pLXSN-LMO3)，negative control group(infected with the pLXSN)and control group.The expression of LMO3 in NIH/3T3 cells was identified by the immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods.ResultsThe pLXSN-LMO3 recombinant retroviral vector had been constructed correctly by restriction enzyme analysis and sequencing analysis，and the value of titer assayed on NIH3T3 cellswas up to an average of 4.04×106cfu/ml.LMO3 albumen expression was detected in NIH/3T3 cells using immunofluorescence histochemistry and Western blotmethods，and LMO3 was highly expressed in experimental group，and the differences in LMO3 expression were statistically significantwhen compared with those in negative control group and control group(P＜0.05).ConclusionThe recombinant retroviral vector carrying LMO3 gene has been constructed successfully，which can highly express LMO3 in NIH/3T3 cells and has potential utility in further gene therapy.

LIM domain only 3;NIH/3T3 cell;Retroviridae infection;pLXSN

R512.99

A

2095-140X(2014)05-0022-05

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.05.006

甘肃省自然科学基金资助项目(1107RJZA106)

730050兰州，兰州军区兰州总医院干部病房

付学锋，E-mail:lkyyfxf@126.com

2013-12-16 修回时间:2014-01-28)

药物分析
·论著·