不同分子量超高脱乙酰度壳聚度糖的制备

柏正武，付克勤，宾 琴，罗迎彬，刘 涛，陈 伟

武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北 武汉430074

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，通常将脱乙酰度大于95%的壳聚糖称为超高脱乙酰度壳聚糖[1]. 与一般的壳聚糖相比，超高脱乙酰度壳聚糖的结构较为规整，可用来制备具有特殊功能的材料. 由甲壳素脱乙酰化制得的壳聚糖通常分子量很大，不溶于普通溶剂，只能在某些酸性介质中溶解，这使壳聚糖的应用受到极大限制. 另外，研究表明分子量对壳聚糖的性质有很大影响，不同分子量的壳聚糖性质差异很大. 所以，为满足制备不同材料对壳聚糖分子量及脱乙酰度的要求，研究超高脱乙酰度壳聚糖的制备非常重要.

降解壳聚糖的化学方法包括NaNO2或H2O2氧化法、酸性或碱性水解法等[2]，用H2O2氧化法制备壳聚糖基本上无副产物，分离提纯方便，是一种较为理想的制备壳聚糖的方法. 但要将高分子量的壳聚糖降解为分子量较小的壳聚糖，就要使用较多量的H2O2，而较多的H2O2能氧化壳聚糖中的氨基，破坏壳聚糖的结构.

在本研究中，以甲壳素为原料，先用两种不同的方法制备不同范围分子量的壳聚糖，再用H2O2氧化法降解壳聚糖，制备出不同分子量的超高脱乙酰度壳聚糖.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent DD 2 400 MHz核磁共振仪(美国安捷伦科技有限公司)；乌氏粘度计(毛细管内径为0.57 mm)；甲壳素，购于青岛潍坊科海生物制品有限公司；正戊醇，购于国药集团化学试剂有限公司；NaBH4购于武汉格奥化学技术有限公司；其它试剂均为分析纯.

1.2 壳聚糖的制备

方法一：正戊醇用孔径40 nm分子筛干燥，反应体系为甲壳素、NaOH和正戊醇，质量比为1∶5∶11，并加入质量分数为1.0%的NaBH4，在154 ℃下反应，反应结束后用蒸馏水洗涤至中性，干燥. 反应1 h制得的壳聚糖称之为C1，反应2 h制得的壳聚糖称为C2，反应3 h制得的壳聚糖称为C3，反应5 h制得的壳聚糖称为C4.

方法二：将甲壳素和H2O按质量比为1∶10相混合，加入NaOH和NaBH4，质量分数分别为45%和1%，加热回流，反应结束后用蒸馏水洗涤至中性，干燥. 脱乙酰反应3 h所得产品为C5；按相同比例投料，间歇脱乙酰化3次，每次2 h，所得产品为C6；间歇反应2次，第一次反应3 h，第二次反应4 h，所得产品为C7；间歇脱乙酰化2次，每次反应4 h，所得产品为C8.

1.3 壳聚糖降解

采用H2O2为氧化剂对壳聚糖进行降解，在中性条件下，将壳聚糖用蒸馏水分散均匀，加热到预定温度，再加入一定量的H2O2. 改变反应时间、H2O2与糖单元摩尔比值(R)以及反应温度，得到不同分子量的壳聚糖. 反应完成后用蒸馏水洗涤至中性，室温干燥.

1.4 壳聚糖分子量的测定

将适量壳聚糖溶于0.1 mol/L的CH3COOH 0.2 mol/L NaCl溶液中，在25 ℃用乌氏粘度计测定流出时间，计算特性粘度[η]，根据Mark Houwink方程(1)计算壳聚糖的粘均分子量Mη[3-6].

[Mη]=KMηα

(1)

K=1.81×10-3cm3/g，α=0.93.

2 结果讨论

先将壳聚糖溶于CF3COOD中，再测量其1H NMR. 在壳聚糖中残留乙酰基的甲基氢化学位移约为2.30，分别对壳聚糖中不同氢的峰进行积分，得出积分面积，乙酰基的甲基氢峰面积为S1，壳聚糖骨架氢峰面积为S2，按公式(2)计算壳聚糖的脱乙酰度(D.D)[3-4].

(2)

在NaOH-正戊醇反应体系中，C1的脱乙酰度为96.1%，C2的脱乙酰度为96.2%，C3的脱乙酰度为97.7%. 在NaOH-水反应体系中，C5的脱乙酰度为93.4%，C6的脱乙酰度为98.2%. 因此适当延长脱乙酰反应时间可增大产品的脱乙酰度. 图1为测量的在NaOH-水反应体系中制备得到的壳聚糖1H NMR谱图. 图1表明经过2次反应，每次反应4 h，所制备的壳聚糖乙酰基中H的峰几乎消失，脱乙酰度近100%.

图1 壳聚糖C8的1H NMR谱图Fig.1 1H NMR of chitosan C8

考虑到壳聚糖中残留乙酰基中的甲基氢的化学环境，可推断化学位移在2.30附近的峰应对应壳聚糖残留乙酰基中的甲基氢. 壳聚糖的分子量不同，或脱乙酰度不同，其残留的乙酰基中的甲基氢的化学位移也略有不同(表1).

比较两种反应体系，以NaOH-水为反应体系制得的壳聚糖分子量大，且脱乙酰更趋完全. 在各种条件下制备的壳聚糖的粘均分子量如表1所示.

表1 不同反应条件下制备的壳聚糖的脱乙酰度及黏均分子量Tabel 1 Degree of deacetylaion and viscosity-average molecular weight of chitosan prepared under different conditions

在用H2O2氧化降解壳聚糖时，若H2O2用量少，则降解程度小，如果用量过大，则导致氨基被氧化，产品颜色加深[7-10]，甚至发生脱氨基现象，严重破坏壳聚糖的结构[11]. 因此制备分子量较小的壳聚糖(如分子量为几万)，就不能使用高分子量的壳聚糖为反应底物，而应该用H2O2降解中等分子量的壳聚糖，这样H2O2的用量不会太大，壳聚糖可保持原有的结构.

改变降解时过氧化氢的用量、反应温度及反应时间，能制得不同分子量的壳聚糖(表2).

反应温度为75 ℃，R值为1.0时，反应时间由30 min延长至90 min，降解后壳聚糖分子量变化不大. C4降解反应30 min后，R值由0.5变为1.0时，降解后壳聚糖分子量由14万降至5.4万，变化显著. 因此H2O2的用量对壳聚糖降解的影响较反应时间和反应温度的影响大，H2O2用量越大降解越快且降解程度越大.

表2 降解条件对壳聚糖黏均分子量的影响Tabel 2 Influence of degradation conditions on viscosity-average molecular weights of chitosan

3 结 语

用正戊醇-NaOH反应体系脱乙酰化5 h可制备脱乙酰度大于98%的超高脱乙酰度壳聚糖，所得到的壳聚糖黏均分子量为24万. 甲壳素在NaOH-水体系中脱乙酰化，间歇反应2次(3 h和4 h)或间歇反应3次(每次2 h)，均可生成脱乙酰度大于98%的超高脱乙酰度壳聚糖，所制得的壳聚糖黏均分子量在81万到100万之间. 延长反应时间，脱乙酰度略有增大，但壳聚糖分子量逐渐减小. 甲壳素在NaOH-水体系中脱乙酰更彻底.

将分子量为24万的壳聚糖降解，在65～75 ℃的温度范围内，改变H2O2用量、反应时间，即可制备粘均分子量在20万以下的超高脱乙酰度壳聚糖. 用相同的方法降解高分子量壳聚糖，可以制备粘均分子量在24万到100万之间的超高脱乙酰度壳聚糖.

致 谢

感谢国家自然科学基金委员会对本工作的资助.

[1] 蒋挺大. 壳聚糖[M]. 北京: 化学工业出社社,2006.

JIANG Ting-da. Chitosan[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2006.(in Chinese)

[2] 欧春艳, 李林通. 壳聚糖降解研究的最新进[J]. 广州化工， 2013, 41(6): 13-15.

OU Chun-yan, LI Lin-tong. Recent progress of study on degreadation of chitosan[J]. Guangzhou Chemical Industry, 2013, 41(6): 13-15.(in Chinese)

[3] 蒋元勋, 李海鹰, 杨文智, 等. 壳聚糖脱乙酰度测定方法的总结与比较[J]. 应用化工，2011, 40(10): 1837-1841.

JIANG Yuan-xun, LI Hai-ying, YANG Wen-zhi, et al. The methods about degree of deacetylation determination of chitosan: summary and discussion[J]. Applied Chemical Industry，2011, 40(10): 1837-1841.(in Chinese)

[4] 林春梅. 壳聚糖黏均分子量的测定[J]. 山东农业科学，2011( 7): 105-106.

LIN Chun-mei. Detection of chitosan molecular weight[J]. Shandong Agricultural Sciences，2011(7): 105-106.(in Chinese)

[5] KWON T H, JUN T K, SOON T J, et. al. Properties of chitosan-based biopolymer films with various degrees of deacetylation and molecular weights[J]. Journal of Applied Polymer Science，2003, 89:3476 -3484.

[6] 寇晓亮, 王琛. 壳聚糖及其降解产物黏均分子质量的测定[J]. 化纤与纺织技术，2010, 39(1): 43-46.

KOU Xiao-liang, WANG Chen. Detection the viscosity-average molecular weight of chitosan and its degradation products[J]. Chemical Fiber & Textile Technology，2010, 39(1): 43-46.(in Chinese)

[7] 王喆. 低分子量壳聚糖的制备[D]. 长春：长春工业大学， 2011.

WANG Zhe. Preparation of low molecular weight chitosan[D]. Changchun ：Changchun University of Technology，2011.(in Chinese)

[8] 郑必胜, 周萌. 壳聚糖氧化降解制备壳寡糖的研究[J]. 现代食品科技，2012, 28(8): 959-963.

ZHENG Bi-sheng, ZHOU Meng. Oxidation degradation of chitosan for preparation of oligochitosan[J]. Modern Food Science and Technology，2012, 28(8) : 959-963.(in Chinese)

[9] 周萌. 壳聚糖的氧化降解及壳寡糖的分离纯化[D]. 广州：华南理工大学，2013.

ZHOU Meng. The oxidative degradation of chitosan and the purification of oligochitosan[D]. Guangzhou：South China University of Technology，2013.(in Chinese)

[10] CHANG K L B, TAI M C, CHENG F H. Kinetics and products of the degradation of chitosan by hydrogen peroxide[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001, 49：4845-4851.

[11] QIN C Q, DU Y M, XIAO L. Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan[J]. Polymer Degradation and Stability，2002, 76: 211-218.