关节软骨创伤早期关节腔内注射透明质酸对软骨细胞凋亡的影响

尤建川，张延玖，何青松，李银和

（达州市中心医院急诊外科，四川 达州635000）

通常而言，利用关节腔（Joint cavity，JC）内注射透明质酸（HA），对于骨关节炎（Osteoarthritis，OA）疾病的治疗有较好疗效，此法亦在临床广泛使用。在发生关节软骨创伤（Articular cartilage injury，ACI）后，CC凋亡高峰往往处于损伤之后的早期［1］。在ACI早期即以HA行JC内注射，对于病患可能比形成创伤型关节炎之后再行JC内注射所获疗效显著。但由于HA缓解软骨细胞（Cartilage cells，CC）损伤的主要机制仍未明确，且HA作用机制与CC凋亡是否有一定联系，目前仍不甚明确［2］。鉴于此，本文通过对ACI后早期患者行JC内注射HA，探讨其对CC凋亡产生的影响，现报告如下。

1 资料和方法

1．1 临床资料 2010年3月～2013年3月，我院有78例患者被确诊为ACI，其中男36例，女42例，年龄56～73岁，平均年龄（63．3±3．8）岁。入选者均满足中华医学会下属骨科学分会2007年制定的ACI诊断标准［3］。排除标准［4］：①有严重胃病或结缔组织类病症者，有风湿免疫类病症者，有血液肿瘤型病症亦或是内分泌代谢类病症者。②有严重心脑肝肾及其他脏器等功能性障碍者。以数字法随机分成观察组和对照组各39例。两组在性别、年龄以及病变情况等方面对比，差异无统计学意义（P＞0．05），具有可比性。

1．2 研究方法 对照组仅以ACI常规抗感染以及手术等方案治疗，观察组在ACI早期缝合皮肤前行JC内注射 HA（产于江苏常州的药物研究所，规格：25mg／2．5ml，药品批号：091003），剂量为2．5ml。

1．3 标本提取 在两组患者创伤之后（观察组在ACI早期缝合皮肤前行JC内注射HA之后操作）提取两组损伤处四周直径约3mm的软骨。平均分成2份，一份以流式细胞仪检测CC凋亡；另一份以TUNEL法观察CC凋亡。

1．4 流式细胞仪测定过程 将软骨剪碎后置入离心管内，行PBS冲洗，在2000r／min下离心约10min，除掉上清液。以0．25%胰蛋白酶进行30min消化处理。在2000r／min下离心约10min，除掉上清液。以0．2%的Ⅱ胶原酶于37℃的恒温箱中消化，隔1h吹打一次。4小时后待软骨全部溶解，实施过滤和漂洗，计数并制备细胞悬液（＞1×106／ml），另加进PI染液，避光下20min，以流式细胞仪测定。经DNA Reagent Kit操作以及Modfit软件对细胞周期实施分析。增殖指数（Proliferation index，PI）＝（S＋G2M）／（S＋G2M＋G0／G1）。

1．5 TUNEL法测定CC凋亡率 将两组软骨经10%福尔马林液固定，时间＞48h。而后递增浓度以乙醇脱水，行石蜡包埋，连续实施5μm切片，PBS替代一抗用于阴性对照，凋亡CC呈现棕黄色。以双盲法统计10个高倍视野。计算100个细胞内阳性细胞总数，并取平均值以作CC凋亡率。

1．6 统计学方法 以SPSS 13．0软件进行分析，计量数据行t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 流式细胞仪测定CC凋亡情况对比 观察组以流式细胞仪测定的CC凋亡率为（3．63±0．46）%，显著低于对照组的（6．87±0．85）%，差异有统计学意义（P＜0．05）。提示ACI早期以HA行JC内注射可明显降低CC凋亡率，见表1。

2．2 TUNEL法测定CC凋亡情况对比 观察组以TUNEL法测定的CC凋亡率为（2．98±0．23）%，显著低于对照组的（6．54±0．17）%，差异有统计学意义（P＜0．05）。提示ACI早期以HA行JC内注射对降低CC凋亡情况的效果明显，见表2。

表1 流式细胞仪测定情况对比（±s）Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

表1 流式细胞仪测定情况对比（±s）Table 1 Comparison of flow cytometry instrument’s test

注：与对照组相比，①P＜0．05

组别 n 凋亡率（×10－2观察组 39 3．63±0．46①对照组 39 6．87±0．85 t 20．94 P＜0．05

表2 TUNEL法测定CC凋亡情况对比（±s）Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

表2 TUNEL法测定CC凋亡情况对比（±s）Table 2 Comparison of Tunel way to test CC apoptosis

注：与对照组相比，①P＜0．05

组别 n 凋亡率（×10－2）观察组 39 2．98±0．23①对照组 39 6．54±0．17 t 77．73 P＜0．05

2．3 两组CC细胞周期情况对比 观察组G0／G1为82．21±2．02，显著低于对照组的91．32±3．65；S、G2／M、PI分别为8．74±2．65、9．08±1．65和 17．81±1．65，均显著高于对照组的3．65±0．27、5．05±0．54和8．71±1．05，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。从而提示ACI早期以HA行JC内注射可优化细胞周期，见表3。

表3 两组CC细胞周期情况对比（±s）Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

表3 两组CC细胞周期情况对比（±s）Table 3 Comparison of 2groups of CC cell cycle

组别 n G0／G1 S G2／M PI观察组 39 82．21±2．02 8．74±2．65 9．08±1．65 17．81±1．65对照组 39 91．32±3．65 3．65±0．27 5．05±0．54 8．71±1．05 t 13．64 11．93 14．50 29．06 P＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 讨论

有报道表明［5］，发生ACI后，患者CC将发生凋亡。因此，在临床上若能抑制或减缓CC凋亡，则可能对后续治疗产生积极意义。HA又称为玻璃酸，其是由Meyer及Palmer等人在1934年时，自牛眼玻璃体内分离而得。而后发现其广泛存于动物及人类机体细胞的外基质内。HA亦为生物活性类物质，是线形多糖。其分子量有所差异，不含均一性。通常在50万至200万间对人体不含抗原性，可发挥稳定细胞间纤维以及膜蛋白的结构等作用。以往主要将其用于预防及治疗OA等疾病，亦取得了一定疗效。因CC表面含有HA受体，HA同细胞表面疏水蛋白经共价键方式结合，从而产生作用［5］。因此HA可防止病患关节软骨发生凋亡及坏死。鉴于此，本文通过对ACI后早期病患行JC内注射HA，探讨其对CC凋亡产生的影响。

本研究发现，ACI后早期病患行JC内注射HA的观察组以TUNEL法测定的CC凋亡率以及TUNEL法测定的CC凋亡率均显著低于对照组的水平。而观察组G0／G1水平，显著低于对照组；但S、G2／M、PI均显著高于对照组的水平。与宋长志，郑闽前等人［7］报道一致，究其原因，主要是HA作为病患关节滑液及软骨的一种组成部分，可发挥关节润滑和营养，以及修复病患关节软骨等效果［8］。发生ACI后，因患处HA水平降低，损伤了软骨完整性，导致关节肿胀和疼痛，以及其他功能性障碍。对于JC内注射并补充外源HA，提升了JC内HA浓度含量。通过修复被破坏的生理性屏障，从而缓解了关节活动，并利于滑膜细胞生成机体自身HA以修复软骨。此外，发生ACI后，软骨细胞增殖活力明显下降，而代谢能力却依然有少量存在，在细胞内蓄积有部分胞内蛋白质和RNA，而细胞无法分裂，因此发生不平衡性生长。此种状态若持续较长时间，则会诱发细胞坏死及凋亡，从而显著提升CC凋亡率。何翠蓉等人［9］报道证实，ACI后早期病患行JC内注射HA，CC凋亡率明显降低约3倍左右，本文为2．19倍，与其报道基本一致。而陆炳全等人［10］亦研究称CC过度凋亡和ACI形成创伤型关节炎有紧密联系。

在细胞周期方面，由于其与细胞的生命活动有紧密联系。调控主要针对于细胞周期的有关限制点，同时由多因素一起参与。在细胞周期内，通常有2个限制点，即G1／S限制点，主要开始于DNA合成期。而另1个则是G2／M限制点，主要开始于有丝分裂时期。而增殖指数和S期的比例通常可作为细胞增殖重要性指标，因此本文在研究CC凋亡的基础上对增殖加以附带研究。结果发现，HA治疗后，PI指数明显上升，这可能是HA在临床上对于OA等疾病治疗后有较好疗效的一些机理。而本文在研究后发现观察组CC增殖活力明显增强的同时CC凋亡率明显下降，国外Trigkilidas D等人［11］经研究后亦发现，ACI后早期行JC内注射以补充外源HA，可明显促进CC增殖，同时降低CC凋亡。这亦可能是对ACI治疗的一种有效途径。然而此种情况的信号通路仍然不甚明确，仍需深入研究下去。

4 结论

ACI后早期患者行JC内注射HA，可明显减少CC凋亡，促进患者康复，疗效肯定，值得临床推广应用。

［1］ 王昌耀，于 丽，王英振，等．不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响［J］．中华临床医师杂志（电子版），2011，5（21）：6213－6220．

［2］ 刘培才，王 东，彭 诚，等．透明质酸钠对颞下颌关节骨关节病患者关节滑液中基质金属蛋白酶2、3的影响［J］．中华口腔医学研究杂志，2011，5（4）：356－360．

［3］ 周建林，刘世清，邱 波，等．透明质酸钠关节腔内注射对兔软骨的保护作用及对过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达的影响［J］．中华风湿病学杂志，2009，13（2）：120－123．

［4］ 邓天政，吕 晶，杨捷绯，等．组织工程骨－软骨复合组织体内异位移植的研究［J］．中国美容医学，2013，22（1）：51－54．

［5］ 朱蓝玉，秦彦国，黄卫东，等．骨性关节炎大鼠模型中透明质酸的表达水平［J］．中国老年学杂志，2013，33（10）：2327－2328．

［6］ 孙晓辉．细胞因子信号抑制因子在骨关节炎患者软骨细胞的表达［J］．细胞与分子免疫学杂志，2013，29（2）：186－189．

［7］ 宋长志，郑闽前，周晓晔，等．创伤后早期关节腔内注射透明质酸对关节软骨细胞凋亡的影响［J］．实用骨科杂志，2013，19（1）：41－43．

［8］ 王琮仁，张 寿．兔骨髓间充质干细胞与透明质酸钠复合修复软骨的实验研究［J］．实用临床医药杂志，2013，17（9）：1－4．

［9］ 何翠蓉，伍 帆．透明质酸钠在青光眼小梁切除术中的应用［J］．西部医学，2010，22（4）：727－728．

［10］ 陆炳全，黄素碧．玻璃酸钠治疗膝骨性关节炎60例疗效观察［J］．西部医学，2010，22（11）：2110－2110．

［11］ Trigkilidas D，Anand A．The effectiveness of hyaluronic acid intra－articular injections in managing osteoarthritic knee pain［J］．Ann R Coll Surg Engl，2013，95（8）：545－551．