液体培养发状念珠蓝细菌代谢物提取方法的比较分析

韩培培，孙 莹，段文倩，石 拓，贾士儒

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

液体培养发状念珠蓝细菌代谢物提取方法的比较分析

韩培培，孙 莹，段文倩，石 拓，贾士儒

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

比较了基于气相色谱–质谱联用技术(GC-MS)发状念珠蓝细菌代谢物的2种不同提取方法．在对样品进行快速洗涤和淬灭后，分别采用冷甲醇法和甲醇/氯仿法对样品进行提取，并考察了样品量对提取效果的影响．结果显示，从提取到的代谢物种类和丰度角度，冷甲醇法的提取效果要优于甲醇/氯仿法，且采用50mg样品量的提取效果较佳．通过本方法，在发状念珠蓝细菌中共检测到46种代谢物，包括19种有机酸、1种无机酸、13种氨基酸、4种胺类、4种醇类和5种糖类物质．

发状念珠蓝细菌；蓝细菌；气相色谱–质谱联用技术；代谢物；提取方法

发状念珠蓝细菌，又叫发状念珠藻(Nostoc flagelliforme)，俗称发菜，是一种陆生蓝细菌，主要分布在荒漠和半荒漠地区，是荒漠中的主要固氮及光合藻类[1–3]．除耐旱特性外，发菜还具有耐碱、抗紫外线、耐高温等能力，研究其抗逆性能有助于了解生物对环境的适应机制[4]．代谢物是细胞对遗传因子或环境因子作出生理响应后的最后产物，对代谢物进行研究可以帮助人们反向解析被研究对象的生理生化状态与预设环境变化之间的关系，从而促进对其中相应机理和本质的理解[5]．本研究通过气相色谱-质谱联用技术对发状念珠蓝细菌的代谢物进行系统研究，建立系统分析代谢物的方法，为进一步从代谢水平上研究发状念珠蓝细菌的抗逆机制奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料

发状念珠蓝细菌(Nostoc flagelliforme)由天津市工业微生物重点实验室保存．

甲醇(色谱纯)、氯仿(色谱纯)，天津化学试剂一厂；吡啶(色谱纯)，Sigma公司；N–甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，Fluka公司；氘标记琥珀酸，ISOTEC公司．

1.2 方法

1.2.1 发状念珠蓝细菌细胞的培养

采用BG11培养基[6]，500mL三角瓶装液量200mL，培养温度(25±0.2)℃，光照度1,000,lx条件下静止培养15,d．

1.2.2 代谢物的提取方法

甲醇/氯仿法：参考文献[7]的方法并进行了优化.

细胞抽滤收集后用液氮研磨成粉末，称取适量细胞粉末，加入–20℃预冷的溶液(V甲醇∶V氯仿∶V水＝2.5∶1∶1)1mL，充分混匀，室温下振荡30min. 14,000r/min离心10min，上清液转入新的EP管中，4℃保存；向残渣中再加入–20℃预冷的代谢提取液(V甲醇∶V氯仿＝1∶1)500µL，充分混匀，室温下振荡30min．14,000r/min离心10min，将两次所得的上清液合并，加入250µL水，充分混匀后，6,400r/min离心20min分层，取150µL上清液，–60℃冻干．其中细胞粉末分别称取30mg和50mg，标记为1-30和1-50．

冷甲醇法：参考文献[8]的方法并进行了优化．细胞抽滤收集后用液氮研磨成粉末，称取适量细胞粉末，加入–20℃预冷的50%甲醇溶液1mL，液氮反复冻融5次，取150µL上清液，–60℃冻干．其中细胞粉末分别称取30mg和50mg，标记为2-30和2-50．

1.2.3 代谢物衍生化

采取两步衍生化法，先加入50µL甲氧基铵盐酸盐的吡啶溶液(20mg/mL)，30℃孵育90min，肟化以保护羰基；再加入MSTFA 80µL，37℃孵育30min，转移到进样瓶中室温静置2h后进行分析．

1.2.4 代谢物的检测

采用GC-TOF-MS(Waters GC-TOF-MS系统，包括配有安捷伦7683自动进样器、安捷伦6890气相色谱和TOF飞行时间质谱仪)对样品进行定性和定量分析．色谱条件：色谱柱为DB–5气相色谱柱(30m× 0.25mm，0.25µm)，进样量1µL，分流比1∶1，进样口温度280℃，接口温度270℃．氦气流量：恒压模式，91kPa．升温程序：70℃保持2min，以5℃/min的速率升到290℃，并在290℃保持6min．质谱参数：放射电流100µA，游离电压70eV，源温250℃，扫描范围(m/z)50～800，扫描速度为每秒2谱图．

1.2.5 色谱峰的识别及定量

色谱峰的识别是通过与NIST library比较完成．采用每种物质的特征离子的单位质量色谱图的峰面积进行定量．

2 结果与分析

通过前期对GC-MS检测条件的优化，建立了基于GC-MS的代谢物检测方法．图1为由GC-MS分析得到的发状念珠蓝细菌胞内代谢物的总离子流图．由图1可知，通过提取方法1-30、1-50、2-30和2-50得到的代谢物对应的总离子流图可以明显看出方法2-30和2-50对应总离子流图的峰更多，即提取到的代谢物种类更多．通过进一步分析，由GCMS检测到发状念珠蓝细菌胞内代谢物可分为以下几类：有机酸、无机酸、氨基酸、胺类、醇类和糖类．

图1 不同提取方法获得的发状念珠蓝细菌胞内代谢物总离子流图Fig. 1 GC-MS chromatograms of irons of intracellular metabolites from Nostoc flagelliforme with different extracting methods

不同提取方法得到的有机酸和无机酸的种类及含量如图2所示．从图2中可以看出：发状念珠蓝细菌中有机酸种类较多，共检测到19种有机酸，且不同有机酸含量差别较大．可以看出冷甲醇法提取到的有机酸种类比甲醇/氯仿法多，冷甲醇法提取到19种有机酸，而甲醇/氯仿法提取到15种有机酸，其中9，12–十八碳二烯酸、9，12，15–十八碳三烯酸、9–十六碳烯酸甲酯和软脂酸未检测到；且对于大多数有机酸，由冷甲醇法提取得到的含量都明显高出甲醇/氯仿法，而2-50又明显优于2-30．

不同提取方法得到的氨基酸种类及含量如图3所示．由图3可知：在发状念珠蓝细菌中检测到了13种氨基酸，且谷氨酸含量较高．除赖氨酸外，冷甲醇法的提取效果明显优于甲醇/氯仿法；除L–苏氨酸、谷氨酸、L–鸟氨酸外，提取方法2-30与2-50差别并不明显．

图2 不同提取方法得到的有机酸和无机酸的种类及含量Fig. 2 Comparison of types and contents of organic and inorganic acids with different extracting methods

图3 不同提取方法得到的氨基酸种类及含量Fig. 3 Comparison of types and contents of amino acids with different extracting methods

不同提取方法得到的胺类物质种类及含量如图4所示．由图4可知：在发状念珠蓝细菌中，检测到了4种胺类物质，分别为羟胺、尿素、乙胺和1，4–丁二胺；其中羟胺和尿素含量相对较少．对于乙胺和1，4–丁二胺，冷甲醇法尤其是采取50mg样品时提取效果更好，而尿素更适合采用甲醇/氯仿法进行提取．对于羟胺，这两种提取方法差别不大．

图4 不同提取方法得到的胺类物质种类及含量Fig. 4Comparison of types and contents of amines with different extracting methods

不同提取方法得到的醇类种类及含量如图5所示．不同提取方法得到的糖类物质种类及含量如图6所示．

图5 不同提取方法得到的醇类种类及含量Fig. 5Comparison of types and contents of alcohols with different extracting methods

图6 不同提取方法得到的糖类物质种类及含量Fig. 6Comparison of types and contents of sugars with different extracting methods

甲醇/氯仿法未提取到丙三醇；冷甲醇法对肌醇和myo–肌醇的提取效果要好于甲醇/氯仿法；对于丙二醇，甲醇/氯仿法和冷甲醇法未呈现明显差别．

由图6可知：在发状念珠蓝细菌中共检测到5种糖类物质，对于吡喃半乳糖、半乳糖、D–果糖，冷甲醇法要优于甲醇/氯仿法；对于葡萄糖，方法1-50提取效果较好．发状念珠蓝细菌中糖类代谢物种类较少，这可能与采用的自养方式有关．

3 讨 论

在代谢物的提取过程中，为了迅速终止细胞代谢反应，取样后会立即进行淬灭处理[9]．本实验采用的是液氮冷冻淬灭法．代谢产物一般用水或有机溶剂分别提取，获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性物质和极性物质分开以便进行分析．因为一些特定提取条件往往仅适合某些类化合物，所以目前尚没有一种能够适合所有代谢产物的提取方法．应该根据不同的化合物选择不同的提取方法，并对提取条件进行优化．Maharjan等[10]研究了6种提取方法冷甲醇、热甲醇、热乙醇、酸、碱和甲醇/氯仿对大肠杆菌代谢物谱的影响，结果表明冷甲醇法可得到更多的代谢物．Dettmer等[11]研究了甲醇、甲醇/水、乙腈、乙腈/水、甲醇/氯仿、甲醇/异丙醇、酸性甲醇7种提取方法对结肠癌细胞株代谢物谱的影响，结果发现甲醇/水提取的代谢物最多．本文选择了冷甲醇和甲醇/氯仿两种提取方法以及两种细胞量进行比较，希望找出一种最优的提取方法．结果表明，发状念珠蓝细菌中主要物质为有机酸、氨基酸、胺类、醇类和糖类，对于大多数代谢物，冷甲醇法的提取效果都明显优于甲醇/氯仿法，而比较2-30和2-50，虽然提取代谢物种类上没有变化，但在离子图上可看出二者信噪比有显著差异．其中信噪比(S/N)以3倍S/N为检出限，10倍S/N为测定下限，使用30mg样品进行实验，有些物质含量较少，低于测定下限，虽然可检测出，但定量时会不准，而50mg的样品量就可以满足要求，因而方法2-50优于2-30，即对于发状念珠蓝细菌，冷甲醇法的提取效率要优于甲醇/氯仿法．并且采用50mg样品量的效果较好．

4 结 论

采用50mg样品量的冷甲醇法适用于发状念珠蓝细菌代谢产物的提取和进一步的GC-MS分析．通过本文建立的代谢物分析方法，在发状念珠蓝细菌中共检测、鉴定到了46种代谢物，其中包括19种有机酸、1种无机酸、13种氨基酸、4种胺类、4种醇类和5种糖类物质．本文工作为进一步从代谢水平上研究发状念珠蓝细菌的生理机制奠定了基础．

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［4］ 唐进年，赵明，张盹明，等. 发菜的生物学特性及资源保护[J]. 中国野生植物资源，2000，19(5)：20-24.

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责任编辑：郎婧

Comparison of Metabolites Extracting Methods from Liquid Cultured Nostoc flagelliforme

HAN Peipei，SUN Ying，DUAN Wenqian，SHI Tuo，JIA Shiru
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

With gas chromatography mass spectrometry(GC-MS)，two kinds of metabolites extracting methods of Nostoc flagelliforme were compared. After being washed and quenched，samples were extracted using the cold methanol method and methanol / chloroform method，respectively. The results suggested that the better extraction effect was achieved with the cold methanol method with the 50mg sample. Through this method，46,kinds of metabolites from Nostoc flagelliforme were detected and identified，including 19,kinds of organic acids，1,kind of inorganic acid，13,kinds of amino acids，4,kinds of amines，4,kinds of alcohols，and 5,kinds of sugar.

Nostoc flagelliforme；cyanobacteria；gas chromatography mass spectrometry(GC-MS)；metabolite；extracting methods

Q93

A

1672-6510(2014)01-0007-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.01.002

2013–05–29；

2013–07–12

国家自然科学基金资助项目(31201405，31271809)；国家级“大学生创新创业训练计划”资助项目(201210057008)

韩培培（1983—），女，山东人，讲师；通信作者：贾士儒，教授，jiashiru@tust.edu.cn.