膜联蛋白Ⅱ在肺癌组织、肺泡灌洗液和胸腔积液中的表达水平及在肺癌诊断中的价值研究

岳红梅，顾 峰，倪志宏，李 佳，高莉萍

肺癌已经成为一种增长快、死亡率高且发病年龄日趋年轻化的恶性肿瘤。寻找理想的肿瘤标记物 (tumor marker，TM)用于肺癌的早期诊断，并能够早治疗已经成为肺癌患者预后的关键。目前临床诊断肺癌时大多数患者已是中晚期，治疗效果差。因此，寻找新的TM已成为新的研究热点。TM是肿瘤在发生发展过程中由肿瘤细胞自身合成、释放或者由机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质。近年来有研究显示，一种新的TM即膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肺癌的发生发展及侵袭转移中发挥着重要作用［1］。但是研究对象多为单一肺癌活检标本，针对AnnexinⅡ在不同标本中的表达少见有报道。本研究对肺癌组织、肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、胸腔积液中的AnnexinⅡ进行检测，以探讨其在肺癌诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年10月—2011年10月兰州大学第一医院呼吸内科收治的肺癌伴胸腔积液患者60例作为试验组，其中男31例，女29例;年龄40～78岁，平均 (55.0±7.4)岁;均经支气管镜、胸腔积液脱落细胞学检查、胸腔镜检查或术后病理检查等确诊为非小细胞肺癌。同时选取该科室结核性渗出性胸腔积液60例作为对照组，其中男30例，女30例;年龄 33～81岁，平均 (52.0±7.8)岁;经痰抗酸染色找到结核菌3例，其余患者均经胸腔镜病理检查证实。两组患者的性别构成、年龄比较，差异无统计学意义 (χ2=0.017，P=0.855;t=0.000，P=1.000)。

1.2 主要仪器及试剂 AnnexinⅡ试剂盒 (上海博古生物科技有限公司)，酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂，酶标仪(奥地利TECAN公司，型号:SUNRISE A－5082)、台式高速冷冻离心机 (上海天美生化仪器设备工程有限公司，型号:CT14RD);DAB(ZLI－9017)试剂盒(北京中衫金桥生物技术有限公司)。AnnexinⅡ兔抗人多克隆抗体 (BA0641，上海博士德有限公司)，工作浓度为1∶200;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(12062010，北京康为世纪生物科技有限公司)，工作浓度为1∶100。

1.3 研究方法及观察指标

1.3.1 胸腔镜检查 依据2010年《英国胸科协会内科胸腔镜指南》［2］对所有患者进行胸腔镜检查，同时留取胸腔积液用于测定AnnexinⅡ水平。

1.3.2 肺癌组织的收集、处理及判读肺癌组织来源于试验组患者的蜡块标本，但其切片用于临床诊断后部分切片已经无法继续使用，最终留下48例患者的蜡块标本待用;正常肺组织来源于该院病理科提供的18例正常肺组织蜡块标本。肺癌组织经100 ml/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规脱水后，制成4 μm厚切片，采用免疫组织化学染色。免疫组织化学染色法按SP法操作进行。染色前肺癌组织进行微波高温抗原修复，一抗4℃过夜，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，中性树胶封片。以磷酸盐缓冲液 (PBS)代替一抗作为阴性对照，其余步骤相同;AnnexinⅡ阳性切片作为阳性对照。AnnexinⅡ阳性染色呈棕黄色或棕褐色，在细胞膜和细胞质中均有表达，但以胞质表达为主。参照文献 ［3］判断免疫组织化学染色结果，每例在显微镜下随机观察5个高倍镜视野，记录癌细胞中染色阳性细胞百分率:(1)显色细胞数＜5%为0分，5% ～25%为1分，＞25% ～50%为2分，＞50%为3分;(2)显色程度无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将每例的显色细胞数积分和显色程度积分相乘，两者乘积≤1分为免疫组织化学反应阴性，2～3分为弱阳性 (低表达)，4～6分为阳性 (中表达)，＞6分为强阳性 (高表达)。结果中低表达、中表达、高表达均为阳性表达。

1.3.3 BALF的收集和处理 按照中华医学会2002年《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范 (草案)》［4］对所有患者行支气管肺泡灌洗术并取得BALF。采用ELISA法检测BALF中AnnexinⅡ的表达水平。

1.3.4 胸腔积液的收集和处理 对所有患者抽取的胸腔积液于30 min内在离心机4℃的环境下以2 000 r/min离心15 min，离心半径为10 cm。取细胞悬液5 ml于微量离心管中，加RNA酶抑制剂后，置于－70℃保存待测。采用ELISA法检测胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以 ()表示，采用两独立样本t检验;计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AnnexinⅡ在正常组织和肺癌组织中的表达 肺癌组织中AnnexinⅡ的阳性表达率(62.5%)高于正常肺组织(16.6%)，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。AnnexinⅡ在肺鳞癌、肺腺癌细胞的细胞膜与细胞质中均有表达，但以细胞质表达为主 (见图1)。

表1 AnnexinⅡ在肺正常组织与肺癌组织中的表达 (例)Table 1 The expression of AnnexinⅡin normal lung tissue and lung cancer tissue

2.2 AnnexinⅡ在肺癌组织中的表达与临床病理因素的相关性分析 AnnexinⅡ在肺癌组织中的表达与患者的性别、吸烟与否、癌细胞分化程度及病理分型无关(P＞0.05);与病理分期以及淋巴结转移有关 (P＜0.05，见表2)。

2.3 试验组和对照组BALF和胸腔积液中AnnexinⅡ的表达 试验组患者BALF、胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平高于对照组，差异有统计学意义 (P＜0.05)。两组BALF中AnnexinⅡ的表达水平分别高于各自组内胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平，差异有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

表3 试验组和对照组BALF和胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平比较 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

表3 试验组和对照组BALF和胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平比较 (，ng/L)Table 3 Comparison of the expression levels of AnnexinⅡin bronchoalveolar lavage fluid and pleural effusion between the two groups

注:BALF=肺泡灌洗液;与 BALF比较，▲P＜0.05

组别 例数 AnnexinⅡBALF 胸腔积液对照组 60 35.99± 6.06 6.95±1.95▲试验组 60 77.92±33.87 15.77±2.26▲t 0.001 0.000 3.841 4.064 P值值

3 讨论

AnnexinⅡ是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，属于膜联蛋白家族的一员。其表达定位于内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经细胞和各种类型的肿瘤细胞。AnnexinⅡ的C末端可以结合钙离子，磷脂以及肌动蛋白，但是结合有赖于N末端的3个位点，即 Tyr23、Ser11、Ser25的磷酸化。N末端有磷酸化和乙酰化修饰位点，N末端的前14个氨基酸残基可以结合p11蛋白 (S100A10)。AnnexinⅡ有单体、异二聚体、异四聚体3种存在形式。异四聚体由蛋白质配体P11蛋白首先自身形成同源二聚体，再和两分子的AnnexinⅡ单体结合形成。异四聚体被证明是其发挥生物学效应的主要形式。编码人类AnnexinⅡ的基因 (大约40 kb)定位于人类染色体15q21，而这一区域被发现与晚期乳腺癌的等位基因的不平衡有关［5］。1990 年 Frohlich 等［6］首次报道 AnnexinⅡ的表达水平升高与肝癌的发生相关，但是研究对象为单一样本。如今多数学者主张多TM联合检测以提高肺癌诊断的准确率［7－8］。

众多研究显示，AnnexinⅡ在多种疾病以及癌症中均有异常表达且与癌细胞的侵袭转移等生物学行为以及预后密切相关［9－13］。 张洵等［14］研究发现，AnnexinⅡ在食管鳞状细胞癌中高表达且与鳞状细胞的分化程度成正相关。还有研究发现，AnnexinⅡ在前列腺癌中表达缺失，抑制前列腺癌细胞的转移但不影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡［15］。目前对AnnexinⅡ在各种癌细胞中的表达情况报道较多，但对其在肺癌中的表达情况报道较少。本研究发现，AnnexinⅡ在肺癌细胞中的阳性表达率为62.5%，高于正常肺组织的16.6%;AnnexinⅡ在肺癌组织中表达于细胞膜和细胞质，且以细胞质表达为主。而在宫颈癌以及肾透明细胞癌中的表达定位于细胞膜和细胞质，以细胞膜表达为主［16］。考虑是由于肺癌细胞质内有较多AnnexinⅡ底物存在所导致。同时本研究还发现，AnnexinⅡ的表达与非肺癌患者的病理分期以及淋巴结转移有关。曾有学者对有无淋巴结转移的肺鳞癌进行研究发现，AnnexinⅡ的表达量在有淋巴结转移的肺鳞癌组织样本中显著升高［17］，提示AnnexinⅡ表达的升高可能与癌细胞的淋巴结转移有关。有研究显示，AnnexinⅡ在调控肿瘤转移和肿瘤血管生成的纤溶蛋白酶原激活系统中发挥着重要功能，AnnexinⅡ和组织型纤溶酶原激活剂(t－PA)相互作用介导了血纤维蛋白酶原转化为纤维蛋白酶，促进了基质金属蛋白酶 (MMP)的激活和细胞外基质(ECM)的降解，激活的MMP几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，从而增强肿瘤细胞的迁移和侵袭作用［18－19］。说明 AnnexinⅡ在肺癌的侵袭转移过程中可能发挥着一定作用。

图1 AnnexinⅡ在肺癌中的表达 (免疫组织化学染色，×400)Figure 1 The expression of AnnexinⅡin lung cancer

表2 AnnexinⅡ在肺癌组织中的表达与临床病理因素的相关性分析〔n(%)〕Table 2 Correlation of AnnexinⅡexpression and clinicopathological factors in lung cancer tissue

AnnexinⅡ作为一种TM，其由肿瘤细胞合成释放。因此，肺癌在发生发展过程中会释放AnnexinⅡ到邻近组织、体液以及血液循环中。本研究显示，试验组患者BALF中AnnexinⅡ的表达水平高于对照组患者。当支气管肺泡上皮发生恶变的时候，产生和释放出的TM使患者支气管肺泡表面被覆液中相应物质发生量和质的改变并随局部循环进入血清。因此，在临床上检测疑似肺癌患者血清中的TM，如癌胚抗原 (CEA)、水溶性细胞角质蛋白19片段(CA211)、卵巢癌抗原(CA125)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)等，用以辅助判断癌细胞是否发生转移或者对疑似癌患者进行筛查。BALF直接来源于气道，而血清TM为肿瘤进一步发展后的间接来源。当肺部发生癌变时，癌细胞分泌或代谢产生的TM首先排泄到癌细胞表面进入局部支气管肺泡内，然后再吸收进入血液循环中，再被血液稀释，其水平进一步下降。且在疾病早期TM产生量较少时，其在血清中水平低，难以检出，而BALF取自病变局部的支气管肺泡内，因此BALF中肿瘤标志物比血清中出现早，水平更高。而对于胸腔积液产生和吸收的机制早已达成共识，即胸腔积液是由于压力梯度从壁层和脏层胸膜的体循环血管通过有渗透性的胸膜进入胸膜腔，然后通过壁层胸膜的淋巴管微孔经淋巴管吸收。由于TM作为一种生物活性物质在体内会随机体的代谢而其水平逐渐降低。因而认为胸腔积液中的TM水平应低于血清中的TM水平。本研究显示，BALF中AnnexinⅡ的表达水平高于胸腔积液。目前临床对胸腔积液的诊断主要依靠常规细胞学分析，但单纯依靠形态学来鉴别肿瘤的敏感度较低，尤其是当胸腔积液内的癌细胞异型性不明显和/或数量较少时，往往会同反应性间皮细胞相混淆，致使临床上经常出现对高度可疑的肺癌性胸腔积液检测时，其反复细胞学检查为阴性结果，但对于胸腔积液中TM的检测不会出现像细胞学检测那样因为恶性细胞少或与间皮细胞混淆或因人为经验判断失误而出现的假阴性结果。同时本研究还发现，在试验组胸腔积液中AnnexinⅡ的表达水平高于对照组，提示可将AnnexinⅡ用于良恶性胸腔积液的鉴别诊断。

综上所述，本研究表明AnnexinⅡ在肺癌患者BALF、胸腔积液以及肺癌组织中均有较高的表达。因此，在BALF、胸腔积液中检测AnnexinⅡ，可作为有价值的TM，对鉴别诊断具有临床价值。且试验组以及对照组BALF中AnnexinⅡ的表达均高于胸腔积液中的表达，提示对BALF中AnnexinⅡ的检测可能优于对胸腔积液中的检测。因此，在对肺癌的诊断中将BALF中AnnexinⅡ作为TM的检测具有更高的敏感度，是一种理想的针对肺癌诊断的TM。

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