酶解制备玉米寡肽的研究

黄 薇，宋永康，*，田宝玉，余 华

（1.福建省农业科学院中心实验室/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州350003；2.福建师范大学生命科学学院/工业微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

酶解制备玉米寡肽的研究

黄 薇1，宋永康1，*，田宝玉2，余 华1

（1.福建省农业科学院中心实验室/福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建福州350003；2.福建师范大学生命科学学院/工业微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

为了高效制备玉米寡肽，本实验对玉米蛋白粉进行超声预处理，以寡肽得率为评价指标，采用复合蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6种蛋白酶对其进行水解，筛选出碱性蛋白酶为制备玉米寡肽的最适水解用酶。通过单因素实验和响应面分析确定制备玉米寡肽的最适工艺条件为：加酶量2660U/g、底物浓度8.0g/100mL、反应温度57.0℃、反应pH为9.0、反应时间3h。在该条件下制备的玉米酶解产物的寡肽得率为34.34%± 0.22%，与理论预测值的相对误差在±1%以内。

玉米蛋白粉，寡肽得率，蛋白酶筛选，响应面分析

运用生物催化技术将低值植物蛋白资源进行高值化、资源化、生态化利用已成为当前食品工业研究的热点[1-3]。我国是玉米生产消费大国，玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副产物，其蛋白质含量可达50%以上[4]。由于所含的蛋白质缺少赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）等人体必需氨基酸，使其在食品中的应用受到很大的限制[5-6]。现代营养研究表明[7-8]，人体对各种氨基酸的利用程度并不完全受单一限制性氨基酸水平的影响，也并不完全遵守营养学经典理论“水桶法则”，相对分子质量低于2ku的寡肽能直接被肠道吸收而被组织利用，并且寡肽具有较强的生物活性和功能特性。研究表明，玉米蛋白粉经蛋白酶酶解后，不仅物理性能得到提高，如高溶解性、低黏度、稳定性好等，其中的一些肽片段还具有抗氧化性、消除疲劳、解酒保肝、降血压等独特的生理活性[9-11]。因此，如何利用玉米蛋白粉制备玉米寡肽，是促进玉米加工工业改造和升级急需开展的研究。

在肽产品中，肽含量反映的是产品品质的一个重要的技术指标。目前，检测肽产品中小分子蛋白含量多采用三氯乙酸（TCA-N）法，其测定结果反映的是分子量小于10ku的可溶性肽；然而在肽产品中寡肽含量（分子量≤2ku）指标才能真实反映肽蛋白的品质[12]。因此，本研究以玉米蛋白粉为原料，提出以寡肽得率为指标，筛选出水解最佳用酶，并对酶解工艺进行优化，制备出高寡肽得率的玉米蛋白酶解产物，旨在为玉米寡肽产业化的提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉 粗蛋白含量52.81%，福州科汇生物技术有限公司；单宁酸、甲醛、氢氧化钠、盐酸等试剂 国药集团化学试剂有限公司；实验用蛋白酶的性能 见表1。

表1 实验用蛋白酶的酶活及性质Table.1 Activities and action conditions of several protein enzymes

Kjeltec 2300自动定氮仪 瑞典Foss有限公司；KQ-250DB台式数控超声仪 苏州江东精密仪器有限公司；TD5A-WS离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；HJ-3恒温磁力搅拌器、3HA-C恒温振荡器常州国华电器有限公司；AL204电子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；PHS-3CpH酸度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米蛋白预处理实验 称取一定量玉米蛋白粉置于反应杯中，按一定比例加水混匀，用氢氧化钠调节溶液pH为11，在超声频率为40kHz，在超声功率45W，温度60℃中超声30min，作为酶反应的底物溶液。

1.2.2 酶解实验 取经过预处理的玉米蛋白溶液，用氢氧化钠或盐酸调节体系pH至酶的反应pH，加入反应所需的蛋白酶，在酶的反应温度下进行酶解反应，水解至预定时间后取出的样品溶液置85℃水浴锅中灭酶10min，5000r/min离心20min，所得上清液即为玉米蛋白酶解产物，保存在4℃待分析用。

1.2.3 寡肽得率的测定 单宁酸溶蛋白含量的测定：参考DB35/T 1089-2011，利用凯氏定氮法测定出玉米蛋白酶解液经16%单宁酸沉淀后滤液中的蛋白含量，测得的结果即为单宁酸溶蛋白含量。

游离氨基酸含量的测定：参考DB35/T 1089-2011，利用甲醛滴定法，测定出经16%单宁酸沉淀后滤液中的游离氨基酸的含量。

总蛋白含量的测定：参考GB5009.5-2010，利用凯氏定氮法测定出玉米蛋白分的蛋白质含量。

寡肽得率（%）=（单宁酸溶蛋白含量-游离氨基酸含量）/总蛋白含量×100

1.2.4 蛋白酶的筛选 在预处理玉米蛋白溶液的基础上，分别加入不同蛋白酶2000U/g，在表1所示最适反应温度和pH的条件下进行水解反应，水解时间6h，每隔1h取样，测定水解玉米蛋白过程中寡肽得率的动态变化趋势。

1.2.5 单因素实验 根据碱性蛋白酶水解玉米蛋白过程中寡肽得率的动态变化结果确定水解时间为3h，研究加酶量、底物浓度、pH、反应温度对玉米蛋白酶解物产寡肽得率的影响。各因素浓度梯度分别为：加酶量：800、1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600、 4000、4400U/g，底物质量浓度：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0g/100mL，pH：6、7、8、9、10，反应温度：45、50、55、60、65℃。

1.开发环保能源，提供创业新动力。在能源紧缺、环境污染严重的今天，开发新型环保替代能源至关重要。作为大学生创业者，要以保护生态环境为中心，在发展自己事业的同时着重保护环境，积极寻找和开发环保能源，不断创新，要致力于打造零污染，零排放的安全放心企业。在开发寻找环保能源的同时，不断引入高科技手段，实现现代互联模式，为创业提供新途径，新思路，也为国家环境的保护做出应有贡献。

1.2.6 响应面实验设计 根据单因素实验结果，固定酶解时间3h，反应pH9.0，运用Box-Behnken中心组合实验设计原理[13]，考虑碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉的加酶量、底物浓度以及反应温度3个因素对玉米寡肽得率的影响，响应面实验因素与水平设计见表2。

表2 响应面优化的因素和水平设计Table.2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 数据处理

响应面实验结果采用Design Expert 8.0进行极差和方差分析。

2 结果与分析

图1 玉米蛋白酶解过程中寡肽得率的变化Fig.1 Dynamic changes in yield of oligo-peptide during hydrolysis of corn gluten meal

2.1 不同蛋白酶酶解产物的寡肽得率分析

不同蛋白酶水解玉米蛋白粉过程的寡肽得率的动态变化趋势见图1。从图1中可知，在同等酶活力条件下，不同蛋白酶水解玉米蛋白的能力具有显著差异。碱性蛋白酶酶解产物寡肽得率最高，水解3h时寡肽得率可达22.60%，之后趋于平缓；其他五种蛋白酶在作用1h后，寡肽得率基本恒定，水解6h所得寡肽得率的大小分别为复合蛋白酶（13.13%）＞风味蛋白酶（8.87%）＞中性蛋白酶（8.37%）＞胰蛋白酶（6.67%）＞木瓜蛋白酶（4.87%）。

相比其他几种蛋白酶，碱性蛋白酶在适宜的条件下对玉米蛋白具有较强的生物活性，同时所得酶解产物的寡肽得率最高，在实际生产中比较切实可行，因此选择碱性蛋白酶作为制备玉米寡肽的水解蛋白酶。

2.2 单因素实验

2.2.1 加酶量对寡肽得率的影响 在底物浓度10.0g/ 100mL、pH8.0、反应温度60℃、酶解时间3h的条件下，测定不同加酶量对玉米寡肽得率的影响，结果见图2。图2中显示，在加酶量800～2800U/g范围中，寡肽得率随加酶量的增加而上升，当加酶量达到2800U/g时，寡肽得率为28.19%，之后进一步增加酶的用量，寡肽得率变化不明显，此时酶分子与底物分子接触达到饱和，转化效率达到最大。综合考虑酶解反应过程，较适加酶量在2800U/g左右。

图2 加酶量对寡肽得率的影响Fig.2 Effect of protease amount on yield of oligo-peptide

2.2.2 底物浓度对寡肽得率的影响 在酶浓度2800U/g、pH8.0、反应温度60℃的条件下酶解3h，测定不同底物浓度酶解后的玉米寡肽得率，结果见图3。从图3中可知，在底物浓度较低时，加大底物浓度，体系寡肽得率不断增加；当底物浓度达到8.0g/100mL时达到最高值，为29.33%，继续增加底物浓度，所得寡肽得率出现缓慢下降的趋势。可能原因是在底物浓度较低时，底物浓度的增加可以加大酶与底物的结合，使得产物增加，但当底物浓度过高，体系流动性较差，不利于蛋白质的充分溶解和分散，使得酶与底物的接触机会也逐渐降低。综合考虑，确定底物适宜浓度在8.0g/100mL左右。

图3 底物浓度对寡肽得率影响Fig.3 Effect of substrate concentration on yield of oligo-peptide

2.2.3 pH对寡肽得率的影响 在底物浓度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、反应温度60℃、酶解时间3h的条件下，测定不同pH对玉米寡肽得率的影响，结果见图4。从图4中可知，pH在6.0～10.0的范围内，寡肽得率的变化趋势为先增大后减小，在pH9.0时达到最高，为31.89%。酶的催化能力与pH密切相关，环境pH能够影响酶分子的构象和酶与底物的解离状态，过高或过低均对酶促反应不利，因此选定pH9.0作为水解的适宜pH。

图4 pH值对寡肽得率的影响Fig.4 Effect of pH value on yield of oligo-peptide

2.2.4 温度对寡肽得率的影响 在底物浓度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、pH为9.0、酶解时间3h的条件下，测定不同温度对玉米寡肽得率的影响，结果见图5。从实验结果中可以知，当反应温度较低（45～55℃）时，体系寡肽得率随温度升高而逐渐上升，于55℃时达到最大值34.03%，而当反应温度较高（55～65℃）时，则体系寡肽得率随温度升高而逐渐下降。环境温度直接影响蛋白酶的酶活力，且在温度较低时，温度升高能加剧蛋白质分子的扩散促使反应加快，但当温度过高时易引起维持酶分子结构次级键解体，导致酶失活。故确定较适反应温度在55℃左右。

图5 反应温度对寡肽得率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3 酶解工艺条件优化

2.3.1 多元二次回归方程的建立与分析 在单因素实验基础上，选取X1加酶量、X2底物浓度、X3反应温度为自变量，以Y寡肽得率为响应值，开展N=17的三因素三水平的Box-Behnken的中心组合设计实验，实验结果见表3。对实验数据进行多元回归拟合，得到寡肽得率拟合回归方程为：

Y=34.09-0.97X1-0.97X2+1.57X3-0.64X1X2+ 0.18X1X3+0.67X2X3-0.61X12-2.98X22-1.23X32

表3 Box-Behnken设计矩阵和响应数据的实测值与拟合值Table.3 Test scheme and its observation and simulation values in BOX-Behnken design

表4 二次多项模型方差分析表Table.4 Analyse of variance for the regression quadratic model equation of Box-Behnken design

由表4的方差分析可知，所得二次多项模型极显著（p值＜0.0001），且失拟项检验不显著（p值=0.4092），表明该模型选择正确；多元相关系数为R2=0.9885，校正决定系数R2Adj=0.9738，表明此回归模型能解释97.38%响应值的变异；模型的信噪比（Adeq precision）为27.301（＞4），说明本模型拟合3个因数与响应值之间的关系是可行的。从3个因素对响应值的影响来看，一次项X1、X2、X3对寡肽得率均有极显著的影响，且影响顺序为X3＞X2＞X1，二次项X12、X22、X32以及交互项X1X2、X2X3对寡肽得率影响显著，二次项X1X3对寡肽得率影响不显著，这表明响应值的变化比较复杂，各实验因素对响应值的影响呈二次关系，且3因素之间存在交互作用。

图6 底物浓度和加酶量交互影响的响应面图Fig.6 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzyme concentration on yield of oligo-peptide

图7 加酶量和反应温度交互影响的响应面图Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for enzyme concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

图8 底物浓度和反应温度交互影响的响应面图Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3.2 响应面分析与优化 分别将模型中的X1、X2、X3中的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素的交互作用对响应值Y的子模型，根据模型分别绘制响应曲面图，见图6～图8。从图中可知，固定反应温度X3=55℃，在X1=2648.64U/g、X2=7.84g/100mL时，寡肽得率达到最大值34.50%；固定底物浓度X2=8.0，在X1=2658.11U/g、X3=56.76℃时，寡肽得率达到最大值34.89%；固定加酶量X1=2800U/g，在X2=7.81、X3= 56.83℃时，寡肽得率达到最大值34.62%，从图6～图8中可以看出，除了加酶量外，随着各因素值的增加，Y值均呈先增大后减小的抛物线变化趋势。利用Design-Expert8.0软件对实验数据进行最优化分析，得到当X1=2659.71U/g、X2=7.96g/100mL、X3=56.74℃时，寡肽得率可以达到最大值34.8947%。

2.3.3 验证实验 考虑到成本及实际操作方便，选择的最优酶解条件为碱性蛋白酶加酶量2660U/g、底物浓度8.0g/100mL、反应温度57.0℃，依据该条件所得的寡肽得率预测值为34.8851%。为了检验模型预测的准确性，在最优酶解条件下水解，做3组平行实验进行模型验证，得到实测寡肽得率的结果分别为34.11%、34.38%和34.54%，与预测值的误差均在±1%以内，表明了所得模型能较好地预测实际酶解情况。

3 结论

3.1 对复合蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等6种商业化蛋白酶酶解玉米蛋白的寡肽得率进行分析。其中碱性蛋白酶相比其他几种酶，效率较高，能获得较高的寡肽得率，是制备玉米寡肽的最佳蛋白酶。

3.2 碱性蛋白酶水解玉米蛋白制备寡肽，体系寡肽得率与加酶量、底物浓度及反应温度显著相关，方差分析显示各因素对玉米蛋白酶解产物的寡肽得率的影响顺序为：反应温度＞底物浓度＞加酶量，建立的回归模型可信。

3.3 根据单因素实验和响应面分析得到碱性蛋白酶酶解玉米蛋白制备寡肽的较佳工艺条件为：加酶量2660U/g、底物浓度8.0g/100mL、反应温度57.0℃、反应pH为9.0、反应时间3h。在该条件下制备的玉米酶解产物的寡肽得率为34.34%±0.22%，与理论预测值的相对误差在±1%以内。

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Enzymatic preparation of corn oligo-peptide

HUANG Wei1，SONG Yong-kang1，*，TIAN Bao-yu2，YU Hua1
（1.Central Laboratory，Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory of Precise Measurement of Agricultural，Fuzhou 350003，China；2.College of Life Sciences/Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350108，China）

In order to prepare corn oligo-peptide efficiently，corn gluten meal was pretreated by ultrasonic. Using the yield of oligo-peptide as the evaluation indicator，Alcalase was screened out from the following six kinds of protease-Protamex，Alcalase，Flavourzyme，Protex7L，Trypsin and Papain.Single factor experiment and response surface methodology were used for optimizing the enzymatic hydrolysis conditions in this study.The optimum hydrolysis conditions were designated as enzyme concentration of 2660U/g，substrate concentration 8.0g/100mL，Enzymolysis temperature of 57.0℃，pH 9.0，and enzymolysis time of 3h.Under these conditions，yield of corn oligo-peptide could reached up to 34.34%±0.22%，which coincided with predictive values with the relative error of less than±1%.

corn gluten meal；yield of oligo-peptide；protease screening；response surface methodology

TS210.9

A

1002-0306（2014）06-0202-05

2013－07－31 *通讯联系人

黄薇（1986-），女，助理研究员，研究方向：食品生物技术。

福建省科技重大专项（2010NZ0002-1）；福建省公益类科研院所基本科研专项（2011R1027-1）。