接种不同优势腐败菌的冷藏猪肉中挥发性物质的研究

洪兆鹏，邹小波，石吉勇，朱瑶迪，黄晓玮

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

接种不同优势腐败菌的冷藏猪肉中挥发性物质的研究

洪兆鹏，邹小波*，石吉勇*，朱瑶迪，黄晓玮

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

为研究接种不同优势腐败菌的新鲜猪肉在4℃冷藏中的变化，将梭状芽孢杆菌、韩国假单胞菌和热死环丝菌分别接种到新鲜猪肉上，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术，研究其在储藏过程中产生的挥发性物质。实验显示，不同样品在48、96、144h贮藏时间下的挥发性成分有较大差异，随着冷藏时间的增加，烷烃类物质种类及含量均明显增加；醇类物质含量增加而醛类物质含量减少；硫氢甲烷、3-甲硫基丙烯等含硫化合物被检测出，但含量较低；酸类物质含量随贮藏时间的延长而逐渐增加；接种梭状芽孢杆菌的样品检测出了高含量的3-羟基-2-丁酮，接种热死环丝菌的样品出现高含量的3-甲基丁醇。结果表明，接菌样品与对照样品的挥发性物质总含量存在显著差异（p＜0.05），即上述3种菌种会对冷藏猪肉的挥发性物质总含量产生显著影响。

猪肉，冷藏，优势菌，顶空固相微萃取（HS-SPME），气质联用（GC-MS）

猪肉营养丰富，在我国肉类市场的占有率很高，一直是我国肉类消费的主题。近些年，随着国人消费观念的提高，人们更加重视猪肉的安全性问题。猪肉的新鲜度可以综合反映肉类的营养性和安全性。猪肉的化学组成主要有水、蛋白质、脂肪、碳水化合物以及少量的维生素和矿物质。在贮藏时，由于组织酶和外界微生物等因素的作用，其新鲜度发生复杂的变化，散发的挥发性成分也发生变化。通过对猪肉散发的挥发性成分的检测分析，可评价猪肉的新鲜度。气质联用（GC-MS）[1]具有客观、准确、快捷地评价挥发性气体，并且具有重复性好的特点。固相微萃取技术（headspace solid phase micro extraction，HS-SPME）是20世纪90年代以来出现的一种挥发性物质分析技术[2]，可以和气相色谱或质谱联系起来，具有简单方便、测试快、费用低，集采样、萃取、浓缩、进样于一体等优点[3]，大大加快了分析检测的速度[4]。近年来已被广泛应用于检测肉类食品中的挥发性物质[5-8]、农产品及食品挥发成分的分析检测，如辐照猪肉[9]、冷却猪肉[10]等挥发成分的分析。

冷藏肉在放置过程中的腐败变质主要是由于嗜冷性微生物的大量增殖造成的，在冷却条件下，肉类中的微生物生长会受到影响，但不会被完全抑制。猪肉在冷藏过程中会受温度、酶、微生物等作用，出现腐败变质，并产生具有异味的挥发性代谢产物[11]。冷却肉上的初始菌相中以韩国假单胞菌、梭状芽孢杆菌和热死环丝菌等为优势菌[12-13]，因而，实验选用韩国假单胞菌、热死环丝菌和梭状芽孢杆菌作为接种菌种，以HS-SPME-GC-MS技术观察不同优势腐败菌在猪肉冷藏过程中产生的挥发性物质及其变化规律，以期对拥有不同初始菌相的冷藏猪肉在贮藏过程中腐败规律的研究提供一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

实验所用样品新鲜的猪里脊肉（屠宰后排酸24h）。

手动SPME进样器、5μm CAR/PDMS萃取头美国Supelco公司；气相色谱质谱联用仪Trace MS，美国Finigon公司；气相色谱毛细管色谱柱Agilent公司；顶空瓶（20mL）、电子天平上海天平仪器公司；超声波清洗器昆山市超声波仪器有限公司；数显鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-276uem6美的冰箱中国美的有限公司；加热搅拌仪韩国；DB-Wax石英毛细管柱色谱柱美国安捷伦公司。

1.2实验方法

1.2.1菌种制备取实验室中从肉中分离并保存的梭状芽孢杆菌、韩国假单胞菌和热死环丝菌菌株用平板倾注法进行平板划线培养，在20℃条件下培养24h。取一环菌苔接种于300mL的液体培养基中培养12～18h，用平板计数法记录平板上菌落数，经计算使菌液浓度达到108CFU/mL，经稀释，确定初始接种量为104CFU/mL，备用[8]。

1.2.2接菌在冷藏环境下将猪里脊肉置于超净工作台，切割成小块，称取5.0g，然后在酒精灯火焰上进行表面灭菌。灭菌后的样品用一定量的无菌水清洗表面，清洗液在平板划线，培养并计数，计算每块猪肉的表面细菌总数均小于102CFU/g，证明灭菌效果良好。取制备好的各腐败菌菌液，为制备好的无菌肉块接种，浸泡时间为10s。接种后沥干菌液，迅速放入20mL顶空瓶中，盖上盖子，贴好标签，立即放置到4℃冷藏室中，待检测其挥发性物质时取用。

1.2.3样品贮藏本实验将未接菌样品和3种接菌样品放在4℃条件下贮藏，分别在0、48、96、144h取出样品，测其挥发性物质成分及含量，每种样品重复测定3次，最后结果取平均值。

1.2.4顶空固相微萃取-气质色谱-质谱条件顶空固相微萃取：萃取纤维头的老化：第一次使用之前，萃取纤维头按照厂家提供的温度、时间进行老化。以后使用时先于300℃下老化30min，再在250℃下不加样品做数次空白，直到解吸空白萃取头的色谱峰不变后再测样品。

取出冷藏样品瓶，置于20℃下平衡10min，然后插入75μm碳分子筛/聚二甲硅氧烷（CAR/PDMS）萃取头，萃取头距猪肉样品相距约1cm，推出萃取头，在60℃水浴吸附40min。

本实验采用的气相色谱毛细管色谱柱，DBWAX石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），气质联用仪的型号为6890N气相色谱系统，5973N质谱系统，70L扩散系真空系统，载气为He，进样口温度为250℃，流速0.8mL/min。采用两段式程序升温：起始温度为40℃，保持4min；然后以5℃/min升温至100℃；再以8℃/min升温至230℃，保持7min[14]。接口温度为230℃，离子源温度为200℃，电离方式为EI+，发射电流为200μA，电子能量70eV，扫描质量范围33～500u，检测器电压350V。分析结果运用NIST库检索，只分析匹配度（SI）和反匹配度（RSI）均在800以上（最大1000）的物质，各化合物的峰面积由系统计算。并结合标准样品进行解谱。

2　结果与分析

2.1猪肉中挥发性物质含量测定

本实验采用HS-SPME-GC-MS法采集得到样品的离子流图，使用NIST05质谱数据库匹配测定样品中挥发性物质含量。图1为接种韩国假单胞菌样品培养144h后得到的GC-MS离子流图。

图1　接种韩国假单胞菌冷藏样品在144h测得的GC-MC离子流图Fig.1　Total ion current chromatogram of volatile components in chilled pork inoculated by Korea pseudomonas with 144 hours storage

猪肉在储藏过程中，由于组织酶和外界微生物等作用，其腐败的情况相差很大，其气味主要是随猪肉新鲜度的变化而变化。本实验采用GC-MS技术检测在三种不同优势腐败菌的条件下猪肉随贮藏时间的延长其挥发性物质的变化情况。样品随着贮藏时间的延长，相继出现了不同的挥发性成分。各种猪肉样品挥发性物质的种类和峰面积见表1。

对照样品分别在48、96、144h下检测样品中的挥发性物质，48h样品共检测出22种挥发性物质，主要为乙醇14.74%、乙酸乙酯4.25%、己醛3.34%；96h样品检测出27种挥发性物质，主要成分为乙醇19.02%、辛烷5.81%、3-甲基丁醇4.32%；144h后样品检测到24种挥发性物质，主要成分有3-甲基丁醇为13.15%，R-2，3-丁二醇4.01%，3-羟基-2-丁酮为11.21%。未接菌样品在贮藏过程中，己醛、庚醛等醛类物质含量明显降低，己醛含量从15.6%逐渐下降到0.42%，戊烷、己烷等烷烃类化合物开始出现，含量也逐渐增加，烷烃类物质总含量由原来的0.94%增加到15.3%，醇类物质含量逐渐增加，并成为主要挥发性物质，主要成分为乙醇和3-甲级丁醇，3-羟基-2-丁酮含量增加到

11.21%，并开始出现少量如3-甲硫基丙烯等含硫化合物。实验中检测出来较高含量的3-羟基-2-丁酮，可能是某些菌分解葡萄糖而产生的[15]，也可能经由微生物产生[16]。图2为对照样品在不同时间测得的挥发性物质种类及含量。

表1　各猪肉样品在不同冷藏时间主要挥发性物质的种类和含量（%）Table.1　Volatile components in chilled pork dominated spoilage bacteria with different storage time（%）

图2　对照样品在不同贮藏时间的挥发性物质及含量Fig.2　Relative contents and volatile components identified in control sample with different storage time

接种梭状芽孢杆菌的样品分别在冷藏48、96、144h时用固相微萃取技术检测样品中的挥发性物质。48h样品共检测出21种挥发性物质，主要有乙醇37.45%，2，3-丁二酮6.91%，3-羟基-2-丁酮19.30%，96h样品共检测到36种挥发性物质，其中乙醇含量占30.42%，乙酸含量6.18%。该样品变化较大之处在于乙醇含量随贮藏时间延长而快速增加，由最初的0.44%增加到37.17%，醇类物质总含量也由2.32%增加到44.14%，己醛含量快速下降到0.45%。实验中检测出来较高含量的3-羟基-2-丁酮，可能是某些菌分解葡萄糖而产生的[15]，也可能经由微生物产生[16]。样品检测出种类较多的烷烃类挥发性物质，这类物质可能来自于猪肉中脂肪酸的降解[17]，因而随着冷藏时间的增加，检测出的烷烃类物质种类数量由原来的2种增多到8种，烷烃类物质总含量由0.94%增加到7.04%。48h样品检测出来了较高含量的2，3-丁二酮，而2，3-丁二酮是微生物代谢活动的副产物[18]，原因可能是低温对微生物的抑制是需要时间的，48h内微生物活动是慢慢减弱的，到96h和144h时，微生物活动就很弱了，因而产生的2，3-丁二酮含量也较低。酯类化合物中，乙酸乙酯开始出现，含量达到4.44%，总含量由0%增加到7.05%，并检测出0.28%的3-甲硫基丙烯。

接种韩国假单胞菌的样品分别在48、96、144h下用固相微萃取技术检测样品中的挥发性物质。48h样品检测到20种挥发性物质，乙醇增加到13.44%，己醛含量从15.6%降低到1.35%，96h样品检测到41种挥发性物质，主要成分为辛烷占4.35%，乙醇占30.02%，2-丁酮占4.65%，144h样品检测到41种挥发性物质，乙醇27.00%，3-甲基丁醇含量上升到5.85%，乙酸4.54%。3-羟基丁酮是微生物发酵的产物，可以发生氧化反应生成2，3-丁二酮，或被还原生成2，3-丁二醇[19]，因而上述三种物质之间联系紧密。乙酸含量由0.34%上升到4.54%，并出现少量的三甲基丁酸，这样的小分子酸类物质主要是微生物降解糖类物质产生的[20]。样品检测出硫氢甲烷和3-甲硫基丙烯等含硫挥发性物质，可能为猪肉蛋白质分解的典型挥发成分，虽然含量很少，但说明猪肉已有腐败的迹象。

接种热死环丝菌样品分别在冷藏48、96、144h后用固相微萃取技术检测样品中的挥发性物质。48h样品共检测到25种挥发性物质，总物质的相对百分含量为63.16%，主要为醇类物质，尤其是乙醇，占总含量的38.50%，酮类物质中主要是3-羟基-2-丁酮，占总含量的10%以上。96h样品检测到34种挥发性物质，总物质的相对百分含量为82.56%，比48h的样品高出约30%，其中3-羟基-2-丁酮含量进一步增加到19.4%，还检测出与之关系密切的2，3-丁二醇和2，3-丁二酮，含量分别为3.38%和1.08%，最高含量的物质仍为乙醇，占总含量的23.42%，醇类物质含量占到总含量的54.90%。样品检测出了硫氢甲烷、甲硫基丙烷和1-甲硫基丙烯，含量都很低，原因可能是样品处于腐败初始阶段，样品中的蛋白质分解程度较低。

2.2猪肉中挥发性物质总含量分析

随冷藏时间变化的增加，未接菌样品和分别接种梭状芽孢杆菌、韩国假单胞菌和热死环丝菌样品的挥发性物质总含量变化趋势基本一致。各样品在不同贮藏时间下的挥发性物质总含量如图3所示。从冷藏0～96h之间，挥发性物质的百分含量都有很明显的增加趋势，冷藏96h后挥发性物质有所降低。在整个冷藏过程中，接种热死环丝菌的猪肉样品产生的挥发性物质含量最高，其次是接种梭状芽孢杆菌的猪肉样品、接种韩国假单胞菌样品。值得注意的是，接种梭状芽孢杆菌的猪肉样品在冷藏0～48h间，产生的挥发性物质含量增加是最快的，但在48h后含量增加缓慢，在冷藏96h后含量降低；在整个冷藏过程中，产生的挥发性物质含量高于接种韩国假单胞菌样品和对照样品。由于在0h样品是接种完菌种后立即测定，因而4种样品测得的挥发性物质总含量差别不明显，而在0h后，3种接菌样品的挥发性物质总含量则显著高于未接菌的对照样品（p＜0.05）。

图3　各样品在不同冷藏时间的挥发性物质含量Fig.3　The total volatile substance in pork with different storage time

3　结论

本实验发现随着冷藏时间的增加，各样品的挥发性成分均发生明显变化。结果显示，不同样品在不同冷藏时间的挥发性成分有明显不同，随着冷藏时间的增加，烷烃类物质种类显著增多，含量增加；醇类物质含量增加，醛类物质含量减少，尤其是乙醇和乙醛，符合微生物ED、HMP发酵途径中乙醛被还原生成乙醇的代谢规律[21]。3种接菌样品检测出了含量高于对照样品的3-羟基-2-丁酮，印证了顾赛麒等[15]关于3-羟基-2-丁酮可能是微生物产生的结论。含氮含磷含硫物质种类较少，主要有硫氢甲烷、3-甲硫基丙烯等，但含量较低；接种韩国假单胞菌的样品检测出了超过总含量30%的乙酸，大幅高于其他样品；到96h和144h时检测出了硫氢甲烷、3-甲硫基丙烯等含硫化合物，表面样品中蛋白质已经发生了分解，样品已发生腐败。在4种样品的挥发性物质总含量上存在显著差异（p＜0.05）。本实验检测冷藏猪肉中不同优势腐败菌产生的挥发性物质，可以为对冷藏猪肉中优势腐败菌的进一步研究提供一些参考。

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Study on detection of volatile components of chilled pork inoculated by different dominating spoilage bacteria

HONG Zhao-peng，ZOU Xiao-bo*，SHI Ji-yong*，ZHU Yao-di，HUANG Xiao-wei
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

In order to study the spoilage characteristics of dominant spoilage bacteria，Pseudomonas koreensis，Clostridium fusiformis and Brochothrix thermosphacta were respectively inoculated into sterilized pork at the storage temperature of 4℃.Volatile compounds of pork with different storage time were analyzed by headspace solid micro extraction（HS-SPME）.Pork with storage time of 48，96，144h and dominant spoilage bacteria had a significant difference in volatile composition.As the time of cold-storage went on，the content of alkanes rose markedly，pork inoculated with Clostridium fusiformis and Brochothrix thermosphacta provided significantly higher levels of 3-hydroxy-2-Butanone and 3-methyl-Butanol，respectively.Contents of sulfhydryl methane and 3-sulfhydryl propylene were actually low.These results showed that at 0.05 significance level，there was significant difference in total volatile substance between pork inoculated by bacteria and control sample.

pork；cold-storage；dominant spoilage bacteria；headspace solid micro extraction（HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

TS207.3

A

1002-0306（2014）06-0111-05

2013－06－17*通讯联系人

洪兆鹏（1988-），男，硕士研究生，研究方向：农产品、食品无损检测。

国家自然科学基金资助项目（60901079）；全国优秀博士基金（200968）；江苏省农业自主创新（CX（11）2028）。