微藻DHA油脂中胆固醇脱除方法的研究

张业峰，胡耀池，黄 和

（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京210009）

微藻DHA油脂中胆固醇脱除方法的研究

张业峰，胡耀池*，黄 和

（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京210009）

为脱除微藻DHA油脂胆固醇，提高油脂品质，选择了β-环糊精包合法、硅胶吸附法和分子蒸馏法，对其进行脱除胆固醇。分析了3种方法脱除胆固醇后，对油脂的酸价、过氧化值、氧化稳定性和脂肪酸组分的影响。结果表明，采用β-环糊精包合法，胆固醇脱除率达50%，高于硅胶吸附法和分子蒸馏法的33%和22%。同时β-环糊精包合法相对于硅胶吸附法和分子蒸馏法明显降低了油脂的酸价，提高了油脂氧化稳定性，对脂肪酸成分几乎无影响。通过对比表明，采用β-环糊精包合法，符合今后微藻DHA油脂脱除胆固醇精炼工艺的要求。

DHA，胆固醇，脱除

DHA（Docosahexaenoic acid，C22∶6Δ4，7，10，13，16，19，全称二十二碳六烯酸）是一种重要的ω-3型长链多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞生长发育，降血脂，降血糖，保护视力，抗癌及提高免疫力等多种重要生理功能，目前已广泛应用于食品和医疗行业[1-3]。利用微生物发酵法生产的DHA油脂，具有易于大规模发酵培养，多不饱和脂肪酸含量高，易分离纯化和氧化稳定性较好等优点[4]。但目前微藻DHA油脂中胆固醇含量高达19.99mg/g[5]。现代医学和营养学研究发现，高胆固醇和饱和脂肪食物的大量摄取易导致血液胆固醇含量升高，而血清中高胆固醇含量被认为是诱发高血压、动脉粥样硬化、冠心病等众多心血管疾病的重要因素[6]。现今微藻DHA油脂作为一种食品添加剂，其过高的胆固醇含量势必会影响微藻DHA油脂的商业化应用。因此，降低其胆固醇含量显得尤为重要。

目前去除胆固醇的方法报道很多，主要有溶剂抽提法、超临界萃取法、吸附法、微生物法、酶法、β-环糊精包合法、分子蒸馏法等[7]。这些方法在黄油、奶油、猪油、奶酪、鸡蛋、牛奶等物质中已被成功脱除90%左右的胆固醇[8-10]，而目前脱除微藻DHA油脂中的胆固醇，鲜有报道。本文选择几种具有工业化应用前景的方法，β-环糊精包合法、硅胶吸附法和分子蒸馏法对微藻DHA油脂进行脱除胆固醇，并考察油脂脱除胆固醇前后的酸价、过氧化值、氧化稳定性、油脂微组分和脂肪酸组分，旨在选择出适合脱除微藻DHA油脂胆固醇的方法，为今后的工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DHA脱色油（产自裂殖壶菌Schizochytrium） 江苏天凯生物科技有限公司；硅胶（400～800目）、β-环糊精 国药集团试剂有限公司；氢氧化钾、氯化钠、正已烷、甲醇、乙醇、BF3-乙醚、氯仿、硫酸、乙酸酐等 均为分析纯。

KDL5型刮模式分子蒸馏设备 德国UIT公司；油脂氧化稳定仪 瑞士万通公司；GC2010型气相色谱仪 日本岛津公司；GZX-9140型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；752s型紫外/可见分光光度计 PerkinElmer公司；TH 48SYLD-1型电子调温电炉 中西远大科技有限公司；M 124A型电子分析天平 意大利BEL有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胆固醇脱除方法

1.2.1.1 分子蒸馏脱除胆固醇法[11]取50g DHA脱色油，设置分子蒸馏真空度0.3Pa，进料预热温度30℃，冷凝水25℃，蒸馏温度达到200℃时，打开进料阀，设定进料速度2m L/m in进料，刮膜器转速150r/m in，反应结束后收集重相，保存待测。

1.2.1.2 β-环糊精包合脱除胆固醇法[8]取50g DHA脱色油于250m L烧杯中，加入5%的β-环糊精、50g去离子水，置于45℃的恒温水浴锅中机械搅拌，转速200r/min，搅拌1.5h后，5000r/min，离心15min，取出上层油样，保存待测。

1.2.1.3 硅胶吸附脱除胆固醇法[12]取50g DHA脱色油于250m L烧杯中，加入5%的硅胶，置于50℃的水浴锅中恒温机械搅拌，转速200r/m in，搅拌1h后，5000r/m in，离心15m in，取出上层油样，保存待测。

1.2.2 胆固醇含量测定 参照GB/T 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》方法测定。

1.2.3 油脂氧化稳定性测定[13]Rancimat法加速氧化：分别准确称取三种方法脱出胆固醇后DHA油脂3.00g置于样品管中，于测定温度70℃、空气流速9L/h的条件下测定DHA油脂氧化的诱导时间。

1.2.4 油脂酸价和过氧化值测定 参照GB/T 5009.37-2003进行分析，其中过氧化值测定采用第一法滴定法。

1.2.5 油脂组分含量测定 按照文献[14]进行脂肪酸甲酯化的操作及GC分析，脂肪酸甲酯化，气相色谱（GC）分析DHA占脂肪酸含量并用十九烷酸（C19∶0）作为内标测定DHA的含量。

1.2.6 胆固醇脱除率计算[15]

式中：M0—处理前微藻DHA油脂胆固醇含量（mg/100g）；M1—处理后微藻DHA油脂胆固醇含量（mg/100g）。

2 结果与讨论

2.1 胆固醇标准曲线的建立

按照1.2.2方法，以胆固醇标准浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘得标准曲线如图1所示。由相关系数可见，R2=0.999，表明相关性很强，因此该曲线可以作为胆固醇定量检测的标准曲线。

2.2 几种脱除胆固醇方法对微藻DHA油脂胆固醇和微组分的影响

采用三种不同的方法脱除微藻DHA油脂胆固醇，从图2看出，β-环糊精包合法对胆固醇的脱除效果最好，胆固醇含量减少到0.67g/100g，远低于未处理脱色油中的胆固醇含量1.35g/100g，胆固醇脱除率达到50%；硅胶吸附法脱除胆固醇效果次之，胆固醇含量0.92g/100g，胆固醇脱除率为33%；分子蒸馏法脱除胆固醇效果最弱，胆固醇含量1.06g/100g，胆固醇脱除率为22%。硅胶在工业中是较好的吸附材料，但是在微藻DHA油脂中脱除胆固醇的效果不尽理想，原因可能是硅胶虽然表面有多孔结构，但孔径不规则，且孔径的大小和胆固醇的分子大小不一致[7]，难达到特异性包埋的效果。分子蒸馏法虽然在其他体系中胆固醇脱除率能达到90%以上，但是在微藻DHA油脂体系中没有显示出很高的脱除率，原因可能是采用分子蒸馏法时，微藻DHA油脂的其他组分与胆固醇存在分子平均运动自由程差别，其他组分进入分子蒸馏的轻相中，而胆固醇分子却大部分留在了分子蒸馏的重相中，导致胆固醇脱除效果不佳。β-环糊精包合法借助其独特的结构，与微藻DHA油脂中的胆固醇结合在一起形成一种既不溶于水也不溶于油脂的包合物[18]，通过离心可以除去。同时从表1可知，分子蒸馏法可以降低油脂中32%的色素，硅胶吸附法可以降低油脂中43%的磷脂含量，β-环糊精包合法对微藻DHA油脂中的微组分变化微弱。由此可知，β-环糊精包合法在微藻DHA油脂脱除胆固醇的效果和对油脂微组分的影响上要优于另外两种方法，它可以很好的指导今后的工业化应用。

图1 胆固醇标准曲线Fig.1 The standard curve of cholesterol

图2 几种方法作用后微藻DHA油脂胆固醇含量和脱除率Fig.2 The cholesterol and cholesterol removal rate of microalgae DHA oil after severalmethods

表1 几种方法作用后微藻DHA油脂的微组分Table 1 Theminor compound inmicroalgae DHA oil after severalmethods

2.3 几种脱除胆固醇方法对微藻DHA油脂氧化稳定性的影响

图3 几种方法作用后微藻DHA油脂的诱导时间Fig.3 The induction time ofmicroalgae DHA oil after severalmethods

为了客观的反映这三种方法对微藻DHA油脂氧化稳定性的影响，本实验采用Rancimat法来比较此三种方法对微藻DHA油脂的相对氧化稳定性，结果如图3所示。Rancimat法评价油脂氧化稳定性的原[9]：在一定的加热温度下，向油样中通入一定流量的空气使油样加速氧化，氧化产生的挥发性小分子如醛、酮、酸等导入到装有蒸馏水的瓶中，通过记录并分析水的电导率变化情况，然后二阶求导计算出诱导时间（电导率变化最快的时间点）；诱导时间越长，表明油样氧化稳定性越强。

从图3可知，氧化稳定性（诱导时间）：分子蒸馏法（0.59h）＜脱色油（0.62h）＜硅胶吸附法（0.89h）＜β-环糊精包合法（0.93h）。由此可以得出：分子蒸馏法作用后油脂氧化稳定性最差，主要是可能是由于分子蒸馏时高温致使油脂中的胡萝卜素及酚类物质大幅降低，或者因为DHA油脂中的微组分在高温条件下分解或者聚合的产物不利于油脂氧化稳定性；硅胶吸附法和β-环糊精包合法均增加了油脂氧化稳定性，这主要归因于使用二者脱除胆固醇的同时，可以夹带磷脂、皂角、水分等不利于氧化稳定性的极性杂质；β-环糊精包合法高于硅胶吸附法，是由于β-环糊精包合法包合胆固醇的同时，会部分包合游离脂肪酸，进而降低了易氧化物质的分解，增加了油脂的氧化稳定性。

2.4 几种脱除胆固醇方法对微藻DHA油脂酸价和过氧化值的影响

由图4看出，微藻DHA油脂的酸价采用β-环糊精包合法下降近50%，其余两种方法均有所降低，油脂过氧化值采用硅胶吸附法后明显高于其他两种方法。这主要由于β-环糊精包合胆固醇的同时部分游离脂肪酸也被包合，致使油脂的酸价降低幅度大[17]。采用硅胶吸附法时油脂的过氧化值明显高于另外两者，可能原因是采用硅胶反应时，部分氧在搅拌过程中溶解在油脂中，且其氧的溶解量大于使用β-环糊精包合时，而分子蒸馏是在一个密闭真空环境中反应的，过氧化值稍有升高有可能是发生在结束后油脂暴露在空气中时夹带的氧，导致过氧化值上升。

图4 几种方法作用后微藻DHA油脂酸价和过氧化值Fig.4 The acid value and peroxide value ofmicroalgae DHA oil after severalmethods

2.5 几种脱除胆固醇方法对微藻DHA油脂脂肪酸组分的影响

气相色谱分析显示，几种方法脱除油脂胆固醇后，微藻DHA油脂中的主要脂肪酸成分一致，个别组分含量有差别，见表2。其中采用分子蒸馏法时可以将微藻DHA油脂中的角鲨烯脱除32%，EPA脱除达27.3%。硅胶吸附法和β-环糊精包合法对油脂的脂肪酸成分影响不大。这主要在于分子蒸馏是利用分子平均运动自由程的差别来实现分离的，EPA和角鲨烯的分子平均运动自由程与其他组分差别明显，在分子蒸馏塔中可以部分除去[11]。而硅胶吸附是一种物理吸附过程，因其对于油脂的脂肪族成分吸附力微弱，故影响不大。β-环糊精包合法则是借助其自身的特殊结构形成的一种化学包合，专一性较强，对油脂脂肪酸组分影响弱。

表2 几种方法作用后微藻DHA油脂脂肪酸组分（%）Table 2 The fatty acid composition ofmicroalgae DHA oil after severalmethods（%）

3 结论

采用β-环糊精包合法、硅胶吸附法和分子蒸馏法对微藻DHA油脂的胆固醇进行研究，考察了此3种方法脱除胆固醇后，对油脂的酸价、过氧化值、氧化稳定性、和脂肪酸组分的影响。采用β-环糊精包合法胆固醇脱除率达50%，高于硅胶吸附法和分子蒸馏法的33%和22%，同时相对于硅胶吸附法和分子蒸馏法，它同时降低了油脂的酸价，提高了油脂的氧化稳定性，对油脂的脂肪酸成分和微组分几乎无影响，是今后工业化应用的方向。

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Cholesterol removal from m icroalgae DHA oil

ZHANG Ye-feng，HU Yao-chi*，HUANG He
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

To imp rove the quality ofm icroalgae DHA oil，these methods ofβ-cyc lodextrin，Silica geland molecular d istillation were respectively adop t to remove the cholesterol in the oil.Effects of the three methods on the acid value，peroxide value，oxidative stability and fatty acid com position were measured.The result ind icated that cholesterol reduction reached 50%，higher than the 33%of silica gelmethod and 22%ofmolecular d istillation method.Moreover，com pared w ith the other two methods，method ofβ-cyc lodextrin decreased oil acid value and imp roved the oxidative stability apparently，and had little effecton the fatty acid com position.The com parison showed thatβ-cyc lodextrin met the requirements for the future removal of cholesterol in m ic roalgae DHA oil refining p rocess.

m icroalgae DHA oil；cholesterol；removal

TS22

B

1002-0306（2014）18-0249-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.046

2013－12－09 *通讯联系人

张业峰（1990-），男，在读硕士研究生，主要从事油脂精炼及分析方面的研究。

国家杰出青年科学基金（21225626）；国家自然科学基金（21406112）；国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA022300；2014AA021206）。