正交设计优化蕨藻红素的微波提取工艺

牛改改，邓建朝，李来好，*，杨贤庆，吴燕燕，郝淑贤，戚 勃，林婉玲

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东广州510300；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266000）

正交设计优化蕨藻红素的微波提取工艺

牛改改1，2，邓建朝1，李来好1，*，杨贤庆1，吴燕燕1，郝淑贤1，戚 勃1，林婉玲1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东广州510300；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266000）

研究了微波辅助法提取羽状蕨藻中蕨藻红素的工艺条件。通过单因素实验探究了微波温度、乙醇浓度、微波时间、微波功率、料液比五个因素对蕨藻红素提取率的影响，并经过正交实验对影响蕨藻红素提取率的参数条件进行优化。确定微波提取最佳工艺条件为：提取溶剂90%乙醇，微波温度50℃，微波功率300W，微波时间15min，料液比1∶40g·mL-1，按此工艺条件进行重复性验证实验得到蕨藻红素的平均提取率为92.93%，RSD为0.5003%。结果表明微波提取率高，稳定性好，且大大缩短了提取时间。

蕨藻红素，微波，正交，提取工艺

近年来的许多研究结果表明，海藻中存在大量结构新颖且具有生理活性的化合物，海藻是生物活性物质的巨大来源[1-2]。羽状蕨藻属于海藻中的一种，也被频频报道含有大量能够被人类利用的活性物质-蕨藻红素[3]。国内外文献表明，蕨藻红素具有显著的促进或抑制植物生长[4]，延缓果实成熟，花朵衰老，竞争性抑制增长激素，除草剂，脱叶剂等作用[5-6]，除此之外蕨藻红素还被发现具有较好的抗肿瘤活性[7]。迄今为止，关于蕨藻红素提取工艺方面的文献报道甚少，而微波作为天然产物提取中一种非常有发展潜力的新型技术，具有穿透力强、效率高、溶剂用量少、提取率高、成本低等优点，已被广泛关注[8]。微波加热可使水等极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦发热，这种剧烈运动可使植物细胞内部结构发生破坏[9]，有助于有效成分的溶出，同时微波提取的副产物少，有利于提纯[10]。

目前，提取羽状蕨藻中蕨藻红素的研究甚少，实验采用微波辅助法提取羽状蕨藻中的蕨藻红素，并采用正交实验法对其工艺条件进行了优化，为之后蕨藻红素的分离纯化及其性质研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羽状蕨藻 采于海南沿海滩涂；乙醇 为分析纯；甲醇 色谱纯；实验用水 均符合GB/T 6682一级水的标准。

MAS-Ⅱ微波仪 上海新仪微波化学科技有限公司；分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；Agilent1100高效液相色谱，配有DAD检测器 美国Agilent公司；超声波清洗仪 德国Elma公司；高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蕨藻红素提取率的测定 采集的羽状蕨藻经过清洗、干燥、粉碎后准确称取2.00g，在一定条件下进行微波提取，提取液定容到100m L，过膜，由高效液相色谱仪测定蕨藻红素的峰面积A，根据因素条件变化对目标峰面积的影响来确定正交实验中的几个因素及其取值范围。正交实验的指标先由蕨藻红素峰面积来表示，找出最优组合，确定蕨藻红素的最佳提取条件。在最佳条件下，等量羽状蕨藻经微波提取后，测定目标峰面积；将滤渣进行二次提取，测定目标峰面积；如此重复操作，直至提取液中目标峰面积接近为零，说明羽状蕨藻中蕨藻红素已提取完全。将多次循环提取液的目标峰面积相加Amax即为2.00g羽状蕨藻中蕨藻红素的总量，计算出各提取条件下蕨藻红素的提取率（提取率=A/Amax）。

1.2.2 高效液相色谱法测定目标峰面积 色谱条件[11-12]：色谱柱为Athena C18-WP，100A，4.6mm×50mm，3μm；流动相甲醇-0.2%冰醋酸（80∶20，v∶v）；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长315nm；流速0.3m L/m in；柱温30℃；进样量20μL。

1.2.3 单因素实验 参考相关文献中蕨藻红素的提取条件[11，13]，选定微波温度、微波时间、微波功率、乙醇浓度和料液比五个因素进行单因素实验。分别对各个因素选取五个水平，来考察各因素对蕨藻红素提取率的影响。

1.2.3.1 微波温度对蕨藻红素提取率的影响 分别精确称取2.00g羽状蕨藻粉末，用80%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20g·m L-1，在600W的微波功率下提取15m in，微波温度选择40、50、60、70、80、90℃六个点，提取液经抽滤后，定容到100m L，由高效液相色谱法测定蕨藻红素峰面积，计算出提取率，以三次实验平均值来表示实验结果。

1.2.3.2 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响 分别精确称取2.00g羽状蕨藻粉末，料液比为1∶20g·m L-1，在60℃，600W的微波条件下提取15min，分别选取60%、70%、80%、90%、100%乙醇为提取溶剂，提取液经抽滤后，定容到100m L，由高效液相色谱法测定蕨藻红素峰面积，计算出提取率，以三次实验平均值来表示实验结果。

1.2.3.3 微波时间对蕨藻红素提取率的影响 分别精确称取2.00g羽状蕨藻粉末，用80%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20g·m L-1，在60℃，600W的微波条件下分别提取5、10、15、20、25m in，提取液经抽滤后，定容到100m L，由高效液相色谱法测定蕨藻红素峰面积，计算出提取率，以三次实验平均值来表示实验结果。

1.2.3.4 微波功率对蕨藻红素提取率的影响 分别精确称取2.00g羽状蕨藻粉末，用90%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶20g·m L-1，微波温度为60℃，微波功率分别在100、200、300、400、500、600W的条件下提取10m in，提取液经抽滤后，定容到100m L，由高效液相色谱法测定蕨藻红素峰面积，计算出提取率，以三次实验平均值来表示实验结果。

1.2.3.5 料液比对蕨藻红素提取率的影响 分别精确称取2.00g羽状蕨藻粉末，用90%乙醇为提取溶剂，料液比选取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g·m L-1五个实验点，在60℃、600W的条件下提取10m in，提取液经抽滤后，定容到100m L，由高效液相色谱法测定蕨藻红素峰面积，计算出提取率，以三次实验平均值来表示实验结果。

1.2.4 正交实验设计 在单因素实验基础上，选取对提取率有较显著影响的4个因素即微波温度、微波时间、微波功率和乙醇浓度，其中料液比对蕨藻红素提取率的影响显著，直接选取1∶40的料液比为固定参数，设计四因素三水平的正交实验方案，以蕨藻红素提取率为指标，通过L9（34）正交实验确定最佳提取条件。正交实验的因素与水平表见表1。

表1 正交实验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 微波温度对蕨藻红素提取率的影响 微波温度对蕨藻红素提取率的影响如图1所示，由图1可知，蕨藻红素提取率随着微波温度的增加先增大后减小。微波温度的升高加剧了分子热运动，增大了摩擦，羽状蕨藻中蕨藻红素溶解及扩散速度加快，提取率显著提高，50℃时提取率最大。继续升温提取率反而降低，是因为蕨藻红素属于生物碱类物质，微波温度升高使得部分有效成分分解，因此50℃为较佳的微波温度。

图1 微波温度对蕨藻红素提取率的影响Fig.1 The effectof temperature on the extraction rate

2.1.2 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响如图2所示，由图2可知，蕨藻红素提取率随着乙醇浓度的增加而增大，当提取溶剂为90%乙醇时，提取率达到最大值，继续增加反而提取率降低。因此90%乙醇为最佳提取溶剂。

图2 乙醇浓度对蕨藻红素提取率的影响Fig.2 The effectof ethonal concentration on the extraction rate

2.1.3 微波时间对蕨藻红素提取率的影响 微波时间对蕨藻红素提取率的影响如图3所示，由图3可知，蕨藻红素提取率随着微波时间的增加先增后降。微波时间短，微波反应系统产生的辐射能不足以改变细胞膜的电位变化，蕨藻红素的溶解受阻，微波时间过长，蕨藻红素的水解加剧，提取率降低，因此，10min为较佳微波时间。

图3 微波时间对蕨藻红素提取率的影响Fig.3 The effect of time on the extraction rate

2.1.4 微波功率对蕨藻红素提取率的影响 微波功率对蕨藻红素提取率的影响如图4所示，由图4可知，微波功率在100～300W内时对蕨藻红素提取率的影响不大，之后随着微波功率的增加提取率呈降低趋势。当微波功率在200W时提取率最大，主要是因为微波功率越大传递能量就越多，使提取液内部出现局部过热现象，而蕨藻红素对微波温度又比较敏感，高温使其分解，从而使提取率下降，因此200W为最佳提取功率。

2.1.5 料液比对蕨藻红素提取率的影响 料液比对蕨藻红素提取率的影响如图5所示，由图5可知，随着溶剂量的增大蕨藻红素提取率增大，1∶40g·m L-1时提取率最大。溶剂量小，固液相浓度差小，传质推动力衰减加快，提取率低；溶剂量增大，传质速率提高，提取率随之增大。料液比为1∶40～1∶50g·m L-1时提取率并无明显增长，考虑提取成本及后续纯化难度，选择料液比为1∶40g·m L-1。

图4 微波功率对蕨藻红素提取率的影响Fig.4 The effectof power on the extraction rate

图5 料液比对蕨藻红素提取率的影响Fig.5 The effect of solid-to-liquid ratio on the extraction rate

2.1.6 各因素与提取率的方差分析 利用SPSS软件对不同提取条件下蕨藻红素提取率进行方差分析[14]，结果如表2所示。由表2可知，微波温度、微波时间、微波功率、乙醇浓度和料液比均对蕨藻红素提取率影响极显著。

表2 单因素实验的方差分析Table 2 Single-factor analysis of variance

2.2 正交实验及其方差分析

根据单因素实验的结果，为进一步考察各因素对蕨藻红素提取率影响的显著性，以及提取的最佳工艺条件，以微波温度、微波时间、微波功率和乙醇浓度为实验因素，以蕨藻红素提取率为指标，用L（934）正交表进行4因素3水平正交实验，各实验测定2次，以平均值为实验结果，见表3，正交实验方差分析见表4。

表3的极差分析结果表明，A微波温度，B微波时间，C微波功率和D乙醇浓度对蕨藻红素提取率影响的主次因素为D＞A＞B＞C。由表4可知，A、B和D因素的影响达到极显著水平（p＜0.01），而C因素的影响不显著（p＞0.05）；说明微波温度、微波时间和乙醇浓度对蕨藻红素的提取率影响显著，而微波功率对蕨藻红素的提取率则影响不显著。其最佳的工艺组合为A2B3C3D2，即微波温度为50℃，微波时间为15m in，微波功率为300W，乙醇浓度为90%，料液比为1∶40g·m L-1。所得的组合为实验组别以外的组合，因此需要进行验证实验，重复操作3次，提取率分别为92.58%、93.46%与92.76%，平均值92.93%大于实验设计表中的任何一组，相对标准偏差（RSD）为0.5003%，重现性好，该工艺稳定可行。

表3 L9（34）正交实验实验设计方案及结果Table 3 L9（34）orthogonal testand results

表4 方差分析表Table 4 Analysis table of variance

3 结论

通过单因素及正交实验得出最佳工艺条件：以体积分数为90%的乙醇溶液作为提取溶剂、微波温度50℃，微波时间15min、微波功率300W，料液比1∶40g·m L-1。在此工艺条件下，蕨藻红素的提取率可达92.93%。正交实验方差分析表明：微波温度、微波时间、乙醇浓度对蕨藻红素的提取率影响显著，而微波功率对蕨藻红素的提取率影响相对不显著。该提取工艺显著提升了蕨藻红素的提取率，为之后蕨藻红素的分离纯化及其性质的研究奠定了基础。

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Optim ization ofm icrowave extraction technology of caulerpin from feathery fern frond by orthogonalexperiment design

NIU Gai-gai1，2，DENG Jian-chao1，LI Lai-hao1，*，YANG Xian-qing1，WU Yan-yan1，HAO Shu-xian1，QIBo1，LINWan-ling1
（1.Key Laboratory ofAquatic ProductProcessing，MinistryofAgriculture，NationalR&DCenter forAquatic ProductProcessing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266000，China）

The op timal extraetion teehnology of caulerpin from feathery fern frond was stud ied by m ierowave assisted extraetion.The effect of the m ic rowave tem perature，ethanol concentration，the m icrowave extraetion times，the m icrowave power and the ratio of solid to liquid on the yield of caulerp in were studied by sing le factor experiments.Then，the op timal p rocessing cond itions of caulerp in were obtained by the orthogonal experiments.The op timal extraction p rocess parameters inc lude 90%ethanol as extraction solvent，m icrowave tem perature of 50℃，m icrowave power of 300W，m ic rowave rad ial time of 15m in and material-liquid ratio of 1∶40g·m L-1.Under the op timal extraction conditions，through dup licated experiment the yield of caulerp in was 92.93%，RSD was 0.5003%.The results showed thatm icrowave extraction rate was extremely high and stab le，and the extraction time was reduced greatly at the same time.

caulerpin；m icrowave；orthogonalexperiments；extraction p rocessing

TS254.9

B

1002-0306（2014）18-0241-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.044

2013－12－17 *通讯联系人

牛改改（1989-），女，硕士研究生，研究方向：水产品加工与质量安全。

国家自然科学基金资助项目（21205138）；国家公益性行业（农业）科研专项（200903030）；国家海洋局海洋公益性行业科研专项（201005020-7）。