罗非鱼皮胶原蛋白肽亚铁螯合修饰及螯合物性质的研究

段 秀，杨成涛，孙 云，孙丽平，庄永亮

（昆明理工大学化学工程学院食品科学研究中心，云南昆明650500）

罗非鱼皮胶原蛋白肽亚铁螯合修饰及螯合物性质的研究

段 秀，杨成涛，孙 云，孙丽平*，庄永亮

（昆明理工大学化学工程学院食品科学研究中心，云南昆明650500）

以罗非鱼皮为原料制备胶原蛋白肽（TSGP），胶原蛋白肽与亚铁盐进行螯合反应，对TSGP亚铁螯合物的理化性质及功能特性进行研究。实验优化得出最佳螯合反应条件是m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH为6.0，反应时间50min，温度35℃。通过荧光光谱、紫外光谱和红外光谱测定发现Fe2+与TSGP的羧基与氨基均可发生配位反应。抗氧化活性测定实验表明，螯合物具有较强的清除DPPH自由基和ABTS+自由基的能力。

罗非鱼皮，胶原蛋白肽，亚铁螯合物，结构，抗氧化

罗非鱼（tilapia）属于鲈形目丽鱼科罗非鱼属，是世界上重要的淡水养殖鱼类。在过去的几年中，罗非鱼的生产量稳步增长，并已成为领先出口的水产品之一。

据报道，罗非鱼皮胶原蛋白占鱼皮干重的70%，国内外对于鱼类胶原多肽进行了大量研究，发现其具有良好的生物活性，如抗氧化活性[1]、降血压活性[2]、抗肿瘤活性[3]以及免疫调节[4]等。此外，鱼皮胶原蛋白活性肽与金属离子如铁、锌、钙等也有很好的螯合活性[5-7]。研究表明，蛋白酶将食品蛋白质水解成肽段，其中有些具有广泛的生理活性，但同时大量肽段没有生物学活性，这些肽段经过一定修饰后具有意想不到的活性[8]。选择合适的蛋白酶水解这些多肽链，并进行适当的修饰，可制备出具有各种生理功能的生物活性肽。近年来随着科学研究的深入，各种修饰生物活性肽不断被发现。

本论文以罗非鱼皮为研究对象，使用中性蛋白酶进行水解，再将制备的罗非鱼皮胶原蛋白肽（TSGP）亚铁螯合修饰，然后对所得TSGP亚铁螯合物进行理化性质及功能性质分析，为TSGP亚铁螯合物的分离、鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼皮 由昆明新海洋食品公司提供；中性蛋白酶（≥6万活力单位） 购买于杰能科国际公司；其他所用试剂 均为分析纯。

AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DHG9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；SB5200D型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；KW 1000DC型数显恒温水浴锅 金坛市科析仪器有限公司；FE20实验室pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；HJ-2磁力加热搅拌器 国华电器有限公司；TDL-40B型离心机 上海安亭科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；真空冷冻干燥机 南京载智自动化设备有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RF-5310PC荧光分光光度计 日本岛津公司；TENSOR27-红外光谱仪 德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼皮胶原蛋白提取 热水提取法[1]：鱼皮解冻后，清洗干净并沥干，然后用7倍体积的0.2%氢氧化钠溶液浸泡并不断搅动，40m in后用流动水冲洗至中性；再用7倍体积的0.2%硫酸溶液浸泡并不断搅动，40min后用流动水冲洗至中性；最后将鱼皮加10倍蒸馏水匀浆，用45℃热水恒温提取12h，离心（5000r/m in，20m in）所得上清液即为胶原蛋白，冷冻干燥后备用。

1.2.2 TSGP的制备 用磷酸盐缓冲液配制10mg/m L的胶原蛋白液，用中性蛋白酶进行水解，酶解条件为pH 7，酶用量5%，温度45℃，时间3h。酶解完成后，95℃灭酶15min，离心收集上清液，即得TSGP。浓缩、冻干后，于-20℃冻存备用。

1.2.3 TSGP亚铁螯合物的制备 设计四因素三水平正交实验，因素水平见表1。以亚铁螯合率为指标，通过极差分析，得出最佳工艺条件。

表1 TSGP亚铁螯合物制备正交实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of TSGP iron-chelating orthogonal experiment

1.2.4 水解度（DH）的测定 根据赵新淮等的方法进行测定[9]。

1.2.5 亚铁螯合活性测定 参照Park等[10]的方法稍作修改，将样品pH调至5.5，取3m L加入0.1m L 2mmol/L FeCl2·4H2O，5min后，再加入0.2m L 5mmol/L菲洛嗪（ferrozine），室温下放置10m in，在562nm处测定吸光值。螯合率计算公式如下：

螯合率（%）=[（A0－（A1－A2））/A0]×100

其中A0：磷酸盐缓冲液（pH 5.5）+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A1：样品+FeCl2·4H2O+菲洛嗪；A2：样品+FeCl2· 4H2O+水。

1.2.6 TSGP氨基酸组成及含量测定 采用高效液相色谱的方法测定。

1.2.7 TSGP亚铁螯合物的定性检测 定性检测：Na2S法[11]。

1.2.8 组成成分测定 水分的测定：直接干燥法；多肽的测定：凯氏定氮法；铁含量的测定：邻菲罗琳比色法。

1.2.9 TSGP亚铁螯合物的结构表征

1.2.9.1 荧光光谱分析 所有实验均在常温下进行，5m in后，分别对样品及样品与FeCl2·4H2O的混合物，在激发波长为289nm，发射波长310～400nm范围内，每隔1nm进行光谱扫描。时间光谱扫描中，激发波长为289nm，发射波长为371nm，每分钟扫描一次。

1.2.9.2 紫外扫描分析 将TSGP以及TSGP亚铁螯合物配成一定浓度的水溶液，在190～400nm范围内进行紫外扫描。

1.2.9.3 红外光谱分析 TSGP和TSGP亚铁螯合物干燥后，分别取适量固体样品和少量干燥的溴化钾放入玛瑙研钵中，在红外灯下充分研磨后，压至透明薄片，用红外光谱仪测定其400～4000nm的红外图谱。

1.2.10 抗氧化活性的测定 根据文献[1]测定1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除活性及羟自由基（·OH）清除活性[1]，根据文献[12]测定2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除活性，根据文献[13]测定血浆铁还原能力（ferric reduction ability plasma assay，FRAP）[13]。

2 结果与讨论

2.1 胶原蛋白提取

用凯式定氮法测得罗非鱼皮中的蛋白质含量为26.71%±0.26%。而经热水提取后的所得的胶原蛋白约占鱼皮总重的18.19%，提取率达到了68.10%。

2.2 TSGP的制备

按照1.2.2所述的条件对鱼皮胶原蛋白进行水解，所得TSGP水解度为12.35%±0.07%。

对TSGP的氨基酸组成进行分析，结果如表2所示，其中Gly所占比例最大，TSGP氨基酸组成中，每1000个氨基酸残基含脯氨酸为272.58个，符合胶原蛋白氨基酸的组成特点。

表2 TSGP氨基酸组成及含量分析Table 2 The analysis of TSGP amino acid composition and content

2.3 TSGP亚铁螯合物的制备

通过前期TSGP亚铁螯合单因素实验结果[1]，选定螯合条件：m多肽∶mFeCl2·4H2O=400∶1，pH为6.0，反应时间40min，温度35℃。以此为基础设计正交实验，对TSGP亚铁螯合物的制备进行优化。由表3分析可知，对实验结果的影响主次顺序为B＞A＞D＞C，即pH对TSGH与亚铁螯合的影响最大，其次是m多肽∶mFeCl2·4H2O，影响最小的是时间，最佳螯合条件为A3B2C3D2m多肽∶mFeCl2·4H2O= 500∶1，pH为6.0，反应时间50m in，温度35℃，利用上述螯合条件进行验证实验，平行测定3次，亚铁螯合率达到99.00%。高于表3其他实验组别的螯合率。

肽的螯合活性与分子量、结构、氨基酸组成以及立体结构有关。TSGP的水解度为12.35%，因此，TSGP的平均分子量在890u左右[14]，适合金属离子的螯合。研究表明，天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的羧基有利于肽与金属离子结合，丝氨酸的羟基和巯基可能有助于铁螯合作用，此外，丝氨酸的磷酸化可以为带正的金属如铁，钙和锌创建合适的螯合位点[15]。TSGP中Asp，Glu和Ser含量相对较高，这可能是TSGP具有较高的亚铁螯合活性的原因之一。

表3 TSGP亚铁螯合正交实验结果Table 3 The orthogonal test results of iron-TSGP chelating

2.4 TSGP亚铁螯合物的表征

2.4.1 TSGP和TSGP亚铁螯合物成分分析 由表4可知，在定性检测TSGP亚铁螯合的过程中，其各个步骤的实验现象符合多肽螯合物的定性检测现象。所以可以确定本实验制备的产品是以多肽螯合物的形式存在的。

由表5可看出，制备的TSGP亚铁螯合物中主要成分是多肽和铁，二者质量百分数分别为60.7%和10.24%，但是其中还有较多的钠盐的存在，这主要是由于酶解时使用磷酸盐缓冲液配制胶原蛋白液及调节pH时加入的NaOH或HCI所致，在后续研究中可以通过透析、超滤等方法进一步纯化产品。

表5 TSGP和TSGP亚铁螯合物成分分析Table 5 The componentanalysis of TSGP andiron-TSGP chelate

2.4.2 荧光光谱图分析 TSGP和TSGP亚铁螯合物的荧光光谱测定见图1。图1（a）显示了在激发波长289nm时，不同反应时间的荧光发射光谱图，从图中可以看出，随时间的变化，发射光谱有略微红移的现象，由图1（b）可以看出10m in之前荧光强度衰减明显，10min之后的变化不明显。在蛋白质折叠/展开研究中，荧光强度下降是肽折叠的一个典型指标。根据荧光动力学（图1b），肽折叠伴随TSGP亚铁螯合的全部过程。金属离子是蛋白质和多肽折叠的关键，尤其是对于短肽，其在水溶液中不具有热力学稳定的结构[5]。

图1 TSGH亚铁螯合荧光光谱图Fig.1 The fluorescence emission spectra of the iron-TSGP chelating

2.4.3 紫外扫描分析 如图2所示，TSGP和TSGP亚铁螯合物最大紫外吸收峰对应波长分别为213nm和205nm，最大吸收峰发生位移。螯合物的生成会使其配位体对光吸收性能发生改变，这是TSGP和铁结合后相应原子的价电子跃迁不同的反映，证明了它们之间发生了螯合反应[7]。

2.4.4 红外光谱分析 如图3所示，对TSGP的红外光谱（A），在特征区，—NH2的吸收峰在3448cm-1；在指纹区，C=O的吸收峰在1652cm-1，-COO-的吸收峰在1407cm-1。TSGP亚铁螯合物红外光谱图（B），在特征区，—NH2的吸收峰移动到了3413cm-1，发生了变化，说明螯合物中的—NH2键发生了化学反应；在指纹区，C=O的吸收峰红移至1660cm-1，-COO-的吸收峰移至1402cm-1，可见，-COO-键也发生了的化学反应，表明氨基和羧基均参与了亚铁的螯合反应。特别地，对于螯合物，在1100cm-1左右出现了的（PtNH2）单吸收峰变成双吸收峰，也证明Fe2+与-NH2有较强结合。由红外吸收峰的偏移或变化进一步证实TSGP和Fe2+之间形成了螯合物[7]。

表4 TSGP亚铁螯合物定性检测结果Table 4 The qualitative test results of iron-TSGP chelate

图2 TSGP和TSGP亚铁螯合肽的紫外吸收曲线Fig.2 Ultravioletabsorption curve of TSGP and iron-TSGP chelate

图3 TSGP和TSGP亚铁螯合肽的红外光谱对比分析Fig.3 Infrared spectrum analysis of TSGP and iron-TSGP chelate

2.4.5 抗氧化活性测定 由表6可以看出，除羟自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明显优于TSGP，螯合物羟自由基清除活性较弱，可能是因为在过渡金属离子（Fe2+）存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢可以产生羟自由基，使得螯合物对羟自由基的清除活性弱于TSGP。

表6 TSGP和TSGP亚铁螯合物抗氧化活性的比较Table 6 The comparison of antioxidantactivity of TSGP and iron-TSGP chelate

3 结论

通过正交实验优化得出TSGP最佳螯合反应条件为m多肽∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH为5.5，反应时间50m in，温度35℃。通过荧光光谱、紫外光谱和红外光谱等手段对TSGP亚铁螯合物的结构进行研究，证实Fe2+和TSGP的羧基与氨基均发生配位反应，TSGP和Fe2+形成了螯合物。通过对TSGP亚铁螯合物的抗氧化活性进行分析，发现除羟自由基清除活性外，螯合物DPPH自由基清除活性、ABTS+自由基清除活性、FRAP都明显优于TSGP，说明TSGP亚铁螯合物可作为一种潜在的抗氧化剂。

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Preparation，characterization and antioxidant activity of tilapia skin collagen polypeptides chelated iron

DUAN Xiu，YANG Cheng-tao，SUN Yun，SUN Li-ping*，ZHUANG Yong-liang
（Research Centre of Food Engineering，College of Chemistry and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

Tilap ia skin collagen polypep tides（TSGP）was p repared and chelated by iron.The physical，chem ical and functional p roperties of the chelate were characterized.The op timum parameters of chelating as follows：mpolypeptides∶mFeCl2·4H2O=500∶1，pH6.0，reaction time 50m in，temperature 35℃.The formation of iron-TSGP chelate was confirmed by the Ultraviolet spectrum and Infrared spectroscopy，and found that the carboxyl and am ino group of TSGP bounded w ith iron.In add ition，chelate had a strong radical scavenging activities of DPPH·and ABTS+·.

tilap ia skin；TSGP；chelate；structure；antioxidantactivity

TS201.1

A

1002-0306（2014）18-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.025

2013－11－07 *通讯联系人

段秀（1990-），女，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全。

国家自然科学基金项目（31101392）。