石漠化地区豆科植物根瘤菌降解碳酸钙、镁能力研究

2014-02-25王明月刘绍雄熊智丁雅迪王艳玲李克艳阳廷丹陶茜王金华

生态环境学报 2014年10期

王明月，刘绍雄，熊智，丁雅迪，王艳玲，李克艳，阳廷丹，陶茜，王金华*

1. 西南林业大学，西南山地森林资源保护与利用省部共建教育部重点实验室，云南昆明 650224；2. 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650223

王明月1，刘绍雄2，熊智1，丁雅迪1，王艳玲1，李克艳1，阳廷丹1，陶茜1，王金华1*

微生物对岩溶地区岩石风化、成土具有明显的促进作用，为了筛选出能够促进碳酸盐岩风化、加快成土速率的优势根瘤菌菌株，将其与豆科植物建立共生体系，进行石漠化地区修复与治理，实验以分离自云南石漠化地区的9株豆科植物根瘤菌为研究对象，将9株根瘤菌接种于加有难溶性碳酸钙或碳酸镁的液体培养液中，28.5 ℃、160 r·min-1摇床培养15 d，于0、1、3、6、10、15 d取样2 mL，每个样3个平行；将样品加入到10 mL体积比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡过夜，放在电热板上缓慢加热至溶液澄清透明，分别用含La3+2%的盐酸溶液定容至10 mL，空白用同样方法处理；最后采用原子火焰吸收方法测定样品中Ca2+和Mg2+含量，筛选出对碳酸盐岩主要成分碳酸钙和碳酸镁具有强降解作用的根瘤菌菌株。结果表明：热带根瘤菌Rhizobium tropici (SWFU09)和根瘤菌Rhizobium sp. (SWFU02)对碳酸钙降解作用最强；对碳酸镁降解作用最好的菌株为根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU03）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值对碳酸镁降解作用具重要的影响，对碳酸钙降解作用影响不大，说明根瘤菌代谢产生的酸性物质（有机酸、氨基酸）对碳酸钙和碳酸镁降解作用有一定影响，但不是唯一影响因素；也可能是微生物代谢产生的有机配体（基）吸附碳酸钙和碳酸镁表面，与水体中的成分形成复合物，改变溶解的平衡，置换出Ca2+和Mg2+。

根瘤菌；降解作用；碳酸钙；碳酸镁

我国是世界上碳酸盐岩分布面积最大的国家，分布面积大约为130万km2，占全国陆地总面积的14%，是世界上最大的岩溶区之一。碳酸盐岩主要由CaMg(CO3)2含量较高的白云岩（mCaCO3：mMgCO3大致为1∶1）和CaCO3含量较高的石灰岩组成（丁丽君，2009；姬飞腾等，2009）。由于碳酸盐岩地区地形地貌复杂，生态环境脆弱，人类活动范围扩大和自然环境日趋恶化使该地区地表植被遭受破坏，土壤严重流失，出现基石大面积裸露或砾石堆积的岩溶地区土地极端退化的现象，即石漠化（王代懿等，2005；刘映良，2005），被称为“生态癌症”。颠、黔、桂三省是我国石漠化最严重的地区，石漠化土地面积6.79万hm2，占3省总面积的18%（郭柯，2011）。近年来石漠化土地面积总体上仍呈扩张趋势（李阳兵等，2005），石漠化已经成为岩溶地区最大的生态问题，石漠化治理刻不容缓（尹育知，2013）。目前我国在石漠化治理主要采用植被恢复方法，改善石漠化土壤理化性质，减少水土流失。

根瘤菌(Rhizobia)是可与宿主豆科植物共生，形成根瘤并将大气中的气态氮固定转化成铵态氮，能够显著促进植物生长，同时还能够增加土壤肥力，改良土壤结构，改善土壤蓄水，提高土壤抗风蚀力，构建根瘤菌-宿主植物共生体系成为了解决石漠化地区植被恢复问题的主要方式（韦革宏和马占强，2010）。李建华等（2010）在山西矿区复垦土壤上种植接种根瘤菌的白三叶草（Trifolium repens L.），结果表明接种根瘤菌能显著提高植物生物量和土壤养分利用率，表明豆科植物因可以与根瘤菌共生固氮而克服退化土壤瘦瘠所带来的障碍，是解决复垦退化土壤中养分缺乏的有效措施。刘晓光等（2006）在内蒙古武川旱农的大田试验发现，对风蚀退化土壤接种根瘤菌能够明显促进团聚体形成，改良土壤结构，提高抗风蚀能力，增加土壤肥力，改善蓄水状况。上述方法是针对岩溶地区已覆盖土壤进行研究，而石漠化问题的关键点在于石漠化地区少土多石，加快石漠化地区岩石风化成土速率，扩大土壤覆盖面积和增加土层厚度才是解决石漠化现状的最主要手段，目前关于这一方面的研究较少。大量研究表明微生物对岩溶地区岩石风化、成土具有明显的促进作用（连宾等，2008；连宾等，2011）。本文以建立豆科植物-根瘤菌共生体系的基础上，进一步筛选出对碳酸盐岩具有一定作用，能够促进碳酸盐岩风化，加快成土速率的优势根瘤菌菌株,为进一步探索石漠化修复和治理提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验用豆科植物根瘤菌由西南林业大学生命科学学院王金华副教授提供。菌株种属鉴定以及与豆科植物的寄主关系如表1。

1.2 仪器与试剂

仪器：恒温摇床培养仪、离心机（Sorvall R RC-3BP）、紫外-可见分光光度计、无菌操作台、1000 mL移液器、笔式pH测定仪（PH600）、250 mL锥形瓶、原子吸收分光光度计990F。

YMA（解钙）：甘露醇10 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，MgSO40.2 g，Nacl 0.1 g，Yeast 0.8 g，CaCO350 g，加去离子水至 1 L，pH 6.8～7.2。

YMA（解镁）：等量MgCO3代替CaCO3，其他物质含量相同。

1.3 种子液、对照及发酵液的制备

1.3.1 种子液制备

将纯化好的SWFU01菌种转接于已灭菌的装有100 mL PDA（丁丽君和连宾，2008）培养基的250 mL三角瓶中，28.5 ℃，160 r·min-1恒温摇床培养3～5 d，制备SWFU01菌液，相同方法制备其他8种菌液。将制备的9种菌液进行分光光度法测定OD值，最后用去离子水将9种菌液稀释成相同OD值作为种子液。

1.3.2 对照及发酵液的制备

纯水对照（对照1）：在250 mL三角瓶中加入100 mL去离子水，灭菌后加入已灭菌的碳酸钙（或碳酸镁）5 g和3 mL去离子水。

培养基对照（对照2）：在250 mL三角瓶中加入PDA培养液100 mL，灭菌后加入已灭菌的碳酸钙（或碳酸镁）5 g和3 mL PDA培养液。

活菌发酵液处理：在250 mL的三角瓶中加入PDA培养液100 mL，灭菌后加入已灭菌的碳酸钙（或碳酸镁）5 g，随后接入3 mL SWFU01菌液，同样方法处理其他8种菌液。将对照和各菌发酵液放入恒温摇床（28.5 ℃，160 r·min-1）中培养，分别在0、1、3、6、10、15 d取样，各3个平行，经10000 r·min-1的高速离心30 min，取上清液通过细菌滤膜（孔径：0. 45 mm）过滤备用。

1.4 碳酸钙和碳酸镁风化程度及发酵液PH值测定

将样品加入10 mL的体积比5∶1的硝酸高氯酸消化液中浸泡过夜，放在电热板上缓慢加热至溶液澄清透明，取下放至室温，分别用含La3+2%的盐酸溶液定容至10 mL，空白用同样方法处理；取前述处理所得的溶液液，用去离子水配成体积比为99∶1的溶液，以原子吸收分光光度计( PE5100PC )测Ca2+（Mg2+）含量，以溶液中Ca2+(Mg2+)含量作为CaCO3（MgCO3）风化程度的指标。用精密酸度计(pH600)同样条件下测定培养15 d的9种菌液和对照样品pH值。

2 结果与分析

2.1 石漠化根瘤菌对碳酸钙降解作用能力的差异和规律

由图1表明，9株根瘤菌对碳酸钙的降解能力存在一定的差异。SWFU09 和SWFU02降解作用最强，SWFU09在培养7 d后Ca2+质量浓度达到430 mg·L-1，7 d后Ca2+质量浓度仍小幅度增长；SWFU02在10 d达到最大降解能力，Ca2+质量浓度达到230 mg·L-1。SWFU07和SWFU08降解能力次之。SWFU03、SWFU04、SWFU05、SWFU06降解作用极弱或没有降解作用。图中亦可看出9株根瘤菌在摇床培养3 d时均出现了极小值点，随后又均出现了不同程度的降解能力的上升情况。可能是因为在0～1 d时培养基中的碳酸钙经振荡培养，使Ca2+质量浓度轻微上升，2～3 d微生物呼吸作用释放CO2与培养液中游离态OH-、Ca2+结合生成难溶物碳酸钙，使Ca2+质量浓度轻微下降，第3 d时Ca2+质量浓度降至极小值点，3～10 d根瘤菌处于对数生长期，菌株的生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃，释放出大量的酶及有机酸类物质，导致碳酸钙溶解，使Ca2+质量浓度迅速上升；10～15 d，菌株的生长处于稳定期，对碳酸钙降解能力下降，碳酸钙达到溶解平衡，所以Ca2+质量浓度趋近于平稳不变。

表1 根瘤菌种属及其宿主Table 1 Rhizobia species identification and hosts

图1 根瘤菌对碳酸钙的降解作用Fig. 1 Rhizobia strains for the degradation of calcium carbonate

由表2可知，9株菌在15 d时pH由大到小顺序为SWFU04＞纯水对照＞ SWFU02＞培养基对照＞ SWFU 07＞ SWFU05＞ SWFU08＞ SWFU01＞SWFU03＞ SWFU09＞ SWFU06；而菌株对碳酸钙的降解速率由大到小顺序为：SWFU09＞SWFU02＞SWFU07＞SWFU08＞SWFU01＞SWFU03＞SWFU04＞SWFU05＞SWFU06，同时通过表2亦可发现SWFU09和SWFU02在培养15 d中pH呈上升趋势，SWFU06的pH降低，根据酸性条件碳酸钙降解效率，SWFU06的效率应该最强，但降解效率最强的是SWFU09和SWFU02，结果说明根瘤菌代谢产生可降低pH的酸性物质对碳酸钙降解作用有影响，但不是唯一影响因素。

表2 不同菌株在PDA培养液摇床15 d内的pH值Table 2 pH changes of cultur with inoculated calcium carbonat degradation rhizobium in 15 d

2.2 石漠化根瘤菌对碳酸镁降解作用能力的差异和规律

由图2表明，3株根瘤菌对碳酸镁的降解作用较好，降解能力分别为SWFU03＞SWFU05＞SWFU01，最大降解能力分别为834、680和632 mg·L-1；其余6株根瘤菌也表现出一定的降解作用，最弱的为SWFU02菌株。同时可以看出，根瘤菌对碳酸镁的降解规律曲线与对碳酸钙的降解规律曲线存在一定的差异，在摇床培养3 d时并未出现凹槽，而是在6 d处SWFU02、SWFU04、SWFU06三株菌出现凹槽，其余菌株未出现。分析原因可能是因为：在0 d，Mg2+质量浓度为380 mg·L-1（图2），高质量浓度Mg2+对根瘤菌的生长起到了抑制作用，延迟了对数生长期的到来。在4～6 d，培养基pH值升高显弱碱性（表2），Mg2+与OH-反应生成Mg(OH)2，同时5～6 d菌株也开始进入对数生长期，对碳酸镁的降解速率加快，同时微生物生长分泌的有机酸等物质中和了培养液中OH-，溶液pH值降低，Mg(OH)2生成量减少，菌株的降解速率与Mg(OH)2的生成速率之差决定了凹槽是否出现。

由表3可知在15 d时，菌株pH值由大到小顺序：SWFU02＞ SWFU06＞ SWFU08＞ SWFU09＞培养基对照＞ SWFU04＞ SWFU07＞ SWFU01＞SWFU03＞ SWFU05＞纯水对照；菌株对碳酸镁的降解能力大小顺序为SWFU03＞ SWFU05＞SWFU01＞SWFU07＞SWFU09＞SWFU04＞SWFU06＞SWFU02，结果说明根瘤菌代谢产生酸性物质对碳酸镁降解作用有重要影响。

图2 根瘤菌对碳酸镁的降解作用Fig. 2 Rhizobia strains for the degradation of magnesium carbonate

表3 接种根瘤菌的降解碳酸镁培养液摇床15 d内pH值变化Table 3 pH changes of the culture with inoculated magnesium carbonate degradation rhizobium in 15 d

3 结论与讨论

3.1 结论

9株豆科植物根瘤菌中，对碳酸钙效降解作用最强的菌株为热带根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU09）和根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU02）；对碳酸镁降解作用效果最好的菌株为根瘤菌Rhizobium sp.（SWFU03）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（SWFU05）和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.（SWFU01）。溶液pH值对碳酸镁降解作用呈负相关，说明根瘤菌代谢产生的有机酸等酸性物质对碳酸镁降解作用有重要影响；溶液pH值对碳酸钙降解作用影响不大，说明根瘤菌代谢产生的有机酸等酸性物质对碳酸钙降解作用有一定影响，但不是唯一影响因素。碳酸钙和碳酸镁的降解作用也可能与微生物代谢产生的有机配体（基）有关，有机配体（基）吸附碳酸钙和碳酸镁表面，与水体中的成分形成复合物，改变溶解的平衡，置换出Ca2+和Mg2+；微生物代谢产生的酶也可影响降解；酶和酚类代谢产物也可能具有一定的影响，需要进一步深入的研究。

3.2 讨论

微生物生长过程中的直接或间接作用，如：微生物可分泌有机酸、无机酸、聚合物，并改变环境的pH、Eh值及氧化还原环境，加速矿物的溶解，促进碳酸盐岩风化（Laura等，2000；Kalinowski等，2000）；真菌吸附作用和菌丝的机械作用对碳酸盐岩风化能力强弱的也具有一定的影响（周跃飞等，2009；窦传伟和连宾，2009）；同时，细菌对碳酸盐岩风化可能还与特殊的蛋白质或酶密切相关（连宾等，2011），诸多研究说明了微生物对碳酸盐岩风化具有重要影响。本研究筛选出来的根瘤菌菌株对碳酸钙、碳酸镁具有不同程度的强降解作用，将其运用到石漠化地区的治理过程中，在石漠化地区种植与此根瘤菌共生的豆科植物，形成豆科植物-根瘤菌共生体系，可降解石漠化地区碳酸盐岩中高含量的难溶性钙、镁，但Ca2+和Mg2+是植物生长所需的微量元素，只有保持适宜低浓度水平才能发挥其正常生理功能。钙离子浓度超过最适浓度时，会使植物细胞的伸长受到抑制；过量的钙离子将会同磷酸盐反应生成沉淀，干扰植物的磷酸代谢体系和以磷酸为基础的能量代谢，绝大多数植物对土壤中钙离子的吸收与土壤离子浓度呈正相关，因此筛选出最适宜的钙镁降解菌株具有重要意义（罗绪强等，2012）。在石漠化地区建立根瘤菌-豆科植物共生体系时，我们同样需要面临的严峻问题是石漠化地区土壤贫瘠，豆科植物生长必须的营养元素匮乏，豆科植物生长成活率低。连宾对含钾岩石微生物转化的研究中发现，解钾微生物具有促进钾岩石风化以及促进岩石中以难溶性状态存在的Ca、K、Al、Fe在岩石中的溶出（刘殿锋，2014）。在石漠化治理方法的研究中，可对已经分离自石漠化地区豆科植物的根瘤菌进行进一步研究，获得对碳酸盐岩及周围土壤中难溶性或难利用的Al、Fe、P、K等微量元素具有溶解作用或对微量元素具有富集作用的根瘤菌菌株，改善石漠化地区植物生长环境，为植物生长提供适宜的环境，建立有效的豆科植物-根瘤菌共生体系提供理论研究基础，为探索更加行之有效的石漠化修复和治理方法提供基础依据。

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Leguminous Plants Rhizobia Degradation of Calcium Carbonate and Magnesium Carbonate

WANG Mingyue1, LIU Shaoxiong2, XIONG Zhi1, DING Yadi1, WANG Yanlin1, LI Keyan1, YANG Tingdan1, TAO Xi1, WANG Jinhua1*

1. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China, Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China；2. Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives, Kunming 650223, China

Microorganism played an obvious role in facilitating the reaction rate of rock weathering and soil formation, in order to attain dominant rhizobium strains promoted the rock weathering and speed up the rate of soil rhizobium, the dominant rhizobium strains established the symbiotic system with leguminous plants to repair and manage the rocky desertification areas, the thesis studied on the 9 strains from leguminous plants rhizobia by the test of doing the strains in liquid medium with difficult soluble calcium carbonate or magnesium carbonate, then, handled with 28.5 ℃, 160 r·min-1and 15 d table culture, sampled 2 ml of three at 0, 1, 3, 6, 10, 15 d. Samples added into the 10 mL digestive juices for a night, nitric acid and perchloric acid volume ratio was 5 to 1 of the digestive juices, heating Slowly, get clear solutions, the capacity to 10 mL by adding 2% hydrochloric acid solution which contain La3+,the same do with blank，used the flame atomic absorption method to determin contents of Ca2+and Mg2+in the samples parallel. We eagered to obtain the certain strains had strong degradation of calcium carbonate or magnesium carbonate. The results showed that the best calcium carbonate degradation strains were Rhizobium tropici (SWFU09) and Rhizobium sp. (SWFU02), the best strains of magnesium carbonate degradation were Rhizobium sp. (SWFU03), Rhizobium tropici (SWFU05) and Bradyrhizobium sp. (SWFU01). The solution pH had an important influence on degradation of magnesium carbonate, but not obvious on calcium carbonate degradation. We could have a conclusion: acid producted by microbial metabolism had a certain influence on degradations of calcium carbonate and magnesium carbonate, but it was not the only factor. Organic ligand (base) also producted by microbial metabolism might adsorpt on calcium carbonate or magnesium carbonate surface, it could form compounds with ingredients in the water, change the balance of dissolution, Ca2+and Mg2+were replaced.

rhizobia; degradation; calcium carbonate; magnesium carbonate

Q933

1674-5906（2014）10-1581-05

王明月，刘绍雄，熊智，丁雅迪，王艳玲，李克艳，阳廷丹，陶茜，王金华. 石漠化地区豆科植物根瘤菌降解碳酸钙、镁能力研究[J]. 生态环境学报, 2014, 23(10): 1581-1585.

WANG Mingyue, LIU Shaoxiong, XIONG Zhi, DING Yadi, WANG Yanlin, LI Keyan, YANG Tingdan, TAO Xi, WANG Jinhua. Study on leguminous plants rhizobia degradation of calcium carbonate and magnesium carbonate [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(10): 1581-1585.

国家基金（31100007）；云南省教育厅基金（2012Z068）

王明月（1987年生），女，硕士研究生，研究方向微生物生理学。E-mail：821107119@qq.com

*通信作者：王金华（1976年生），女，副教授。E-mail：46639881@qq.com

2014-07-24