雄激素调节耐多西他赛前列腺癌细胞肺耐药蛋白的表达

蒋照辉　李和明　蒋军辉等

[摘要] 目的 肿瘤多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因，肺耐药蛋白（LRP）可诱导多药耐药，我们研究雄激素对前列腺癌的LRP表达影响。 方法 人前列腺癌细胞株LNCaP及PC-3在含多西他赛的培养液中诱导成为耐药细胞株，耐药细胞株分别在含有DHT培养液和在含DHT及比卡鲁胺培养液中培养7d。免疫细胞化学及Western Blot检测两组细胞的LRP表达。 结果 LRP在LNCaP及PC-3细胞系的表达明显低于LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel细胞系，DHT诱导后，LNCaP/Docetaxel及PC-3/Docetaxel细胞系的LRP表达明显增加，经DHT及比卡鲁胺联合作用后，LRP的表达明显低于DHT诱导后。 结论 多西他赛可诱导前列腺癌LRP表达， 二氢睾酮可诱导耐多西他赛前列腺癌的LRP增量表达，雄激素受体阻断剂比卡鲁胺可阻断二氢睾酮的诱导作用。

[关键词] 雄激素；前列腺癌；多药耐药；肺耐药蛋白

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）04-0017-03

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为发病率最高的恶性肿瘤，虽然我国前列腺癌的发病率低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。

内分泌治疗是晚期前列腺癌的主要治疗方法，大多数前列腺癌患者起初对内分泌治疗均有效，但经过中位时间14～30个月后，几乎所有前列腺癌都将逐渐发展为激素难治性前列腺癌。目前以多西他赛为基础的化疗已经成为激素难治性前列腺癌标准的一线治疗方案，病情缓解期为4～10个月，中位数生存时间为9～18个月。肿瘤多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因，肺耐药蛋白（LRP）是目前研究较多的肿瘤耐药相关蛋白，但在前列腺癌中的表达只有很少报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人前列腺癌细胞株LNCaP及PC-3（中科院上海细胞库），RPMI-1640培养液（Sigma 公司），LRP抗体IgG（Santa Cruz公司），PVDF膜（Millipore公司）， 多西他赛（江苏恒瑞医药公司，批号201209304），二氢睾酮DHT（Sigma 公司），比卡鲁胺（康为世纪公司）。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1雄激素对耐多西他赛难治性前列腺癌细胞株的诱导 人前列腺癌细胞株LNCaP及PC-3分别培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100 mg/L的RPMI-1640培养液中， 0.25%胰蛋白酶消化传代，收集生长旺盛的细胞用于实验。含多西他赛浓度0.8μg/mL（1/5治疗剂量的血药浓度），与LNCaP及PC-3细胞共同培养7 d，每7天增加多西他赛浓度0.8μg/mL， 直至在含多西他赛浓度4μg/mL（正常治疗剂量的血药浓度）的RPMI-1640培养液中，细胞能稳定生长传代，建立LNCaP及PC-3耐多西他赛细胞系（LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel）。将LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel分为两组，一组细胞在含有100nmol/L DHT的RPMI-1640培养液中培养7d建立LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT细胞株，另一组在含100nmol/L DHT及1μg/L比卡鲁胺RPMI-1640培养液中培养7d建立LNCaP/docetaxel-DHT-比卡鲁胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡鲁胺细胞株。

1.2.2 LRP的免疫细胞化学 将LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡鲁胺及PC-3/Docetaxel-DHT-比卡鲁胺分别接种于盛有盖玻片的24孔板中，细胞爬满盖玻片后，取出盖玻片用4%多聚甲醛4℃固定15min，PBS洗3次，20%正常羊血清室温孵育30min，分别加入LRP鼠单克隆抗体IgG（1∶1000），37℃ 2h，PBS 洗3次，EnVision试剂（HRP/R）37℃30min，DAB显色12min，苏木精染色，树脂封片；显微镜下观察，背景呈紫蓝色，阳性产物呈棕黄色或黄色。图像应用图像分析软件分析。

1.2.3 Western Blot 检测LRP表达 用蛋白裂解液于冰浴裂解LNCaP及PC-3、LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel、LNCaP/docetaxel-DHT及PC-3/docetaxel-DHT、LNCaP/docetaxel-DHT-比卡鲁胺及PC-3/docetaxel-DHT-比卡鲁胺细胞15min，14 000 ×g，离心15min。取上清液移入新的离心管中-80℃保存待用。取少量上清按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤进行定量。100℃煮沸变性10min，冰浴5min后上样。取出上样至0.5mL进行电泳，电泳时间一般4h，电压60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。取下PVDF膜，置于湿盒中用5%BSA封闭2h，加入LRP鼠单克隆抗体（1∶1000），4℃摇床过夜，PBS洗15min×3，加入兔抗鼠二抗（1∶5000），室温，反应1h，混合等体积化学发光剂AB液，放射自显影，放入Bio-Rad化学发光仪检测结果定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0 统计学软件，等级资料采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LRP表达细胞免疫结果

LRP主要表达在细胞胞浆，LNCaP及PC-3细胞系LRP的表达强度为+（15/100、9/100），明显低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel细胞系表达强度++（45/100、38/100）（χ2=6.134，P=0.043；χ2=5.367，P=0.048）；DHT诱导后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel细胞系LRP的表达强度为+++（78/100、70/100）（χ2=7.456，P=0.031；χ2=7.123，P=0.034），比卡鲁胺阻断DHT后LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel细胞系LRP的表达强度++（42/100、22/100）（χ2=7.986，P=0.028；χ2=7.363，P=0.030）。

2.2 Western blot 结果

LRP在LNCaP及PC-3细胞系的表达明显低于LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel细胞系，DHT诱导后， LNCaP/docetaxel及PC-3/docetaxel细胞系的LRP表达明显增加，经DHT及比卡鲁胺联合作用后，LRP的表达明显低于DHT诱导后（图1）。

3 讨论

近年来我国前列腺癌的发生率呈现上升趋势，发现时多数为晚期，雄激素阻断是晚期前列腺癌的主要治疗方法，起初大多数患者对雄激素阻断治疗有效，但经过14～30个月后，几乎所有患者病变都将逐渐发展为激素难治性前列腺癌。目前以多西他赛为基础的化疗已经成为激素难治性前列腺癌的标准一线治疗方案，但化疗的有效缓解期为4～10个月，并逐渐发展为对多种化疗药物产生耐药，从而导致治疗失败。

肿瘤出现多药耐药的原因为肿瘤本身固有的耐药现象和经化疗药物诱导产生的耐药能力。肺耐药相关蛋白（LRP）是Scheper等[1]在肺癌中首先发现，LRP过度表达在许多实体肿瘤和肿瘤细胞株中发现[2-4]。LRP在细胞中参与药物的囊泡运输，可把细胞核内的药物转运至核外，形成囊泡包裹药物，使化疗药物不能发挥作用，并胞吐排出细胞，从而介导多种化疗药物的耐药。Kerr 等[5]报道LRP高表达容易导致卵巢浆液性癌对卡铂耐药。Tsuji报道LRP的表达是白血病母细胞诱导化疗抵抗的一个危险因素，抑制LRP表达可有效增加化疗效果[6]。律洁等[7]报道抑制A549/DDP细胞中Src酪氨酸激酶活性可降低细胞LPP表达，从而逆转肿瘤细胞多药耐药性。李祥春等[8]报道塞来昔布可以下调胃癌细胞株中耐药基因LRP的表达，逆转多药耐药作用。

刘津等[9]报道人鼻咽癌多药耐药细胞株LRP在蛋白水平及mRNA水平的表达高于亲本细胞，表明LRP的表达上调与其耐药机制有密切关系。韩冰等[10]报道氟尿苷耐药绒癌细胞系LRP基因的表达随着诱导药物浓度和肿瘤细胞耐药性的增加而逐渐上调。我们发现LNCaP及PC-3前列腺癌细胞株均有不同水平的LRP表达，而经过多西他赛诱导后LRP表达明显增加。我们的结果提示多西他赛治疗一段时间后，可诱导耐药蛋白LRP表达，从而使前列腺癌细胞获得继发性耐药。这结果表明，前列腺癌细胞株LNCaP及PC-3通过LRP的表达，即有部分的耐药能力，通过多西他赛的诱导后，LRP可表达增加，前列腺癌耐药可能同时具有继发性和原发性耐药，导致化疗失败。

曾有报道提示雄激素可加快前列腺癌多药耐药的发生，雄激素受体阻断剂可部分纠正雄激素的诱导多药耐药的作用[11，12]，Ho[13]报道雄激素可增加多药耐药蛋白4（MRP4）的表达，而氟他胺可阻断雄激素的诱导作用。王素霞等[14]报道在乳腺癌中雌激素受体表达与肺耐药相关蛋白成正相关。Wartenberg[15]报道外源性丙酮酸可诱导前列腺癌细胞DU145的P-gp表达，加快细胞表柔比星外排，从而逆转肿瘤细胞耐药。我们发现耐多西他赛的人前列腺癌细胞株LNCaP及PC-3经二氢睾酮诱导后，LRP表达明显增加，而通过比卡鲁胺阻断雄激素受体后，比卡鲁胺可阻断二氢睾酮的LRP表达。

综上所述，耐多西他赛诱导前列腺癌的耐药相关蛋白LRP表达增加，而二氢睾酮可诱导耐多西他赛前列腺癌的耐药相关蛋白LRP增量表达，雄激素受体阻断剂比卡鲁胺可阻断二氢睾酮的诱导作用，提示在临床晚期前列腺癌化疗时保持去势状态，可减少前列腺癌多药耐药的产生。

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（收稿日期：2013-10-31）

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（收稿日期：2013-10-31）