牛结核γ—干扰素ELISA检测方法在检疫工作中的应用

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（1.新疆兵团第八师兽医站，新疆石河子832000；2.新疆兵团畜牧兽医总站，新疆乌鲁木齐830063；3.青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛 266100；4.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266109）

牛结核γ—干扰素ELISA检测方法在检疫工作中的应用

周培校1，李 静2，张鲁安2，李 杰2，曹 瑞3，张喜悦4，李 岩2

（1.新疆兵团第八师兽医站，新疆石河子832000；2.新疆兵团畜牧兽医总站，新疆乌鲁木齐830063；3.青岛瑞尔生物技术有限公司，山东青岛 266100；4.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266109）

为评价牛ɣ—干扰素ELISA检测方法检测牛结核的效果及国产试剂盒的检测效果，本试验首先将国产试剂盒与Prionics试剂盒对42份相对阳性的样品和105份相对阴性的样品进行对比研究。然后对5个规模化牛场的3000头奶牛首先进行国产单纯结核菌素颈部皮内变态反应试验，3天后选取皮内变态反应阳性和可疑及部分阴性牛共418头，进行牛ɣ—干扰素试验。结果国产试剂盒对阳性和阴性样品的检测敏感性和特异性分别为95.2%和100%，与Priobics试剂盒的符合率为99.3%。表明国产试剂盒与进口试剂盒的检测能力一致，牛ɣ—干扰素检测方法准确可靠。5个牛场的3000头奶牛单纯结核菌素颈部皮内变态反应试验阳性为138头，可疑105头。ɣ—干扰素试验对418头奶牛的检测，其中阳性74头，与颈部皮内变态反应（可疑牛暂时视为阴性）的符合率为60.5%。

牛结核；ɣ—干扰素；ELISA；检疫

牛结核是重要的人畜共患病，近年来，我国的牛结核疫情加重，严重威胁了畜牧业的发展和人类的健康[1]。动物感染结核后，其免疫主要是细胞免疫，目前的检测也主要是针对细胞免疫。结核菌素皮内变态反应试验是我国的国标检测方法，但实际应用表明该方法的敏感性和特异性均较低，而且需要两次接触动物，重复检测需要间隔至少60天[2]。在此期间科学家们也在不断寻求其他的检测方法，1989年Wood[3]等描述了一种简单的体外检测方法，该方法检测经结核菌素（purif i ed protein derivative， PPD）刺激培养16-24小时的全血释放的IFN—ɣ，其基本原理是PPD递呈到全血中的淋巴细胞后，感染牛分枝杆菌的细胞就能产生IFN—ɣ，未感染的不会产生IFN—ɣ。因此，IFN—ɣ的检测与牛结核的感染密切相关[4-5]。该方法用牛PPD和禽PPD分别刺激全血，敏感性和特异性都高于皮肤试验[6-10]。Wood等[11]在澳大利亚的研究表明该方法的敏感性为95.2%特异性为96.3%。目前，此方法已被澳大利亚、新西兰和欧美许多国家批准为正式试验[12-13]。OIE将此方法列为皮内结核菌素试验的替代试验或平行试验，两者同时应用可提高敏感性，对牛结核的净化意义重大。

近几年，国内不断引进与评价该方法在我国的应用，并自主研发试剂盒，其中青岛瑞尔生物研发的牛结核ɣ—干扰素ELSIA试剂盒完全按照理论原理进行研发[14]，制备并选取了两株特异性的牛IFN—ɣ单克隆抗体，该方法为双单抗夹心法测定牛全血刺激上清中的牛IFN—ɣ。ELSIA板包被牛IFN—ɣ单克隆抗体，当加入全血刺激上清后进行孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的牛IFN—ɣ单克隆抗体，孵育。洗涤后加TMB显色。根据牛型PPD、禽型PPD和PBS刺激上清的对比，判定是否感染牛结核。此试剂盒操作步骤与进口试剂盒相比，操作更加简单，也缩短了操作时间。

由于进口IFN—ɣ检测试剂盒价格昂贵，不利于在我国推广使用，本研究的主要目的是对国内试剂盒进行对比评价并进行初步应用，为降低检测成本，大力推广ɣ—干扰素试验方法提供实验依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

国产牛结核ɣ—干扰素ELISA试剂盒，购自青岛瑞尔生物技术有限公司；进口牛结核ɣ—干扰素试剂盒，瑞士Prionics公司；国产牛结核菌素，购自黑龙江生物制品一厂。

1.1.2临床检测动物

3000头奶牛来自于新疆地区5个奶牛场，通过近几年的检测显示5个牛场均有轻度牛结核病流行。

1.2方法

1.2.1阳性和阴性牛刺激上清的制备

无菌采集147头奶牛的肝素抗凝血，每份全血分别用牛PPD、禽PPD和PBS刺激，37℃+5%CO2培养16-24小时，收集上清。其中12头阳性牛剖检检查阳性，并分离出牛分枝杆菌（见表1），30头皮内变态反应阳性牛来自于同一牛场，间隔60天重复检测均为阳性，但未进行剖检及分菌检查，界定为相对阳性动物。105头阴性牛为近三年检测，皮内变态反应试验结果均为阴性，但未进行剖检及分菌检查，因此未能确定为真阴性动物，视为相对阴性动物。

1.2.2刺激上清的ELISA试验

将147份刺激上清分别用Prionics试剂盒与国产试剂盒同时检测。操作步骤以国产试剂盒为例，每孔加入100µL待检上清室温孵育1h。洗涤，每孔加入100µL酶标抗体室温孵育1小时。洗涤后每孔加入100µL底物溶液，室温避光10min。加入终止液，测定OD450nm值。当牛PPD-禽PPD≥0.1且牛PPD-PBS≥0.1（OD值）时判为阳性，当牛PPD-禽PPD＜0.1或牛PPD-PBS＜0.1（OD值）时判为阴性。

1.2.2.1国产试剂盒的敏感性评价

对12份真阳性和30份皮内变态反应阳性牛刺激上清进行分析，评价试剂盒的诊断敏感性，敏感性=检测阳性样品数/总阳性样品数。

1.2.2.2国产试剂盒的特异性评价

对105份近三年检测阴性牛的样品进行ɣ—干扰素试验，分析评价试剂盒的诊断特异性。特异性=检测阴性样品数/总阴性样品数。

1.2.2.3与Prionics试剂盒的符合率

将国产试剂盒的检测结果与Prionics试剂盒的结果进行对比分析，符合率=（试剂盒检测阳性样品为阳性的样品数+ 试剂盒检测阴性样品为阴性的样品数）/ 样品总数。

1.2.3临床检测应用

对新疆地区5个奶牛场的3000头奶牛进行检测，首先用结核菌素皮内变态反应试验进行检测，3天后对皮内变态反应试验阳性和可疑牛及部分阴性牛进行ɣ—干扰素试验。

1.2.3.1结核菌素皮内变态反应试验

参照国标－动物结核病诊断技术（GB/T18645—2002）进行。阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4mm。可疑反应：局部炎性反应不明显； 皮厚差大于或等于2.0mm，小于4.0mm。阴性反应：无炎性反应；皮厚差在2.0mm以下。

1.2.3.2ɣ—干扰素试验

结核菌素皮内变态反应试验后采集阳性、可疑和部分阴性牛的肝素抗凝全血，8小时之内运送至实验室。全血用24孔培养板培养，每份全血分别用牛PPD、禽PPD和PBS刺激37℃+5%CO2培养16～24小时，收集上清。上清用国产ELISA试剂盒进行检测，阳性对照OD＞0.7且阴性对照OD＜0.15 时ELISA试验成立

1.2.3.3数据分析

对结果进行对比分析。

2 结果

2.1敏感性试验结果

12头阳性牛剖检大部分见特征性病理变化，肺部有黄豆大小的结核结节，结节剖检可见米黄色干酪样，淋巴结肿大，剖检可见干酪样病变等。其中2号牛与7号牛未见明显病变。12头牛组织分菌均为牛分枝杆菌，经分型鉴定为同一SPOLIGOTYPING型[15]。国产试剂盒检测结果为11头阳性，1头阴性，敏感性为91.7%，结果见表1。

表1 12头阳性牛的皮肤试验结果与ɣ—干扰素结果

30份皮内变态反应阳性牛，ɣ—干扰素检测结果为阳性29头，敏感性为96.7%。结合12头阳性牛的结果，对42头阳性牛的敏感性为95.2%。

2.2特异性试验结果

对105份皮内变态反应阴性样品进行检测，ɣ—干扰素结果均为阴性，特异性为100%。

2.3与Prionics试剂盒的符合率

对147份样品进行国产试剂盒与Prionics试剂盒的对比分析，12份菌株分离阳性样品的结果完全一致，30份皮内变态反应阳性牛的对比结果为Prionics阳性28，国产阳性29。Prionics结果阴性的2头牛，其中1头国产试剂盒结果也为阴性。两头牛的结果见表2。

表2 2头皮肤试验阳性牛的ɣ—干扰素试验对比结果

105头皮内结核菌素试验阴性牛，两种试剂盒的ɣ—干扰素试验均为阴性，特异性为100%。通过实验数据对比分析，两个试剂盒的符合率为99.3%，结果见表3。

表3国产试剂盒与Prionics试剂盒的对比结果

2.4临床检测结果

对新疆地区5个奶牛场的3000头奶牛进行检测，首先用结核菌素皮内变态反应试验进行检测，对结果阳性、可疑牛及部分阴性牛进行ɣ—干扰素试验，结果对比如下。

3000头奶牛，单纯结核菌素颈部皮肤试验阳性138头，可疑105头，阳性率为4.6%。

对皮内变态反应试验的138头阳性奶牛，105头可疑奶牛和阴性的175头奶牛共418头进行ɣ—干扰素试验复检。其中阳性74头。若将禽型OD-牛型OD＞0且牛型OD值-PBS值≥0.1判为禽型感染，则禽阳性为27头。皮内变态反应阳性牛有超过一半ɣ—干扰素试验检测为阴性。其中皮内变态反应阴性和可疑牛中也有部分牛ɣ—干扰素试验检测为阳性。若将皮肤试验可疑牛视作阴性，则两者的符合率为60.5%，结果见表4。

表4 ɣ—干扰素试验与单纯结核菌素颈部皮肤试验结果的比较

3 讨论

牛结核是一种慢性进行性传染病，临床症状不典型。在感染后期可出现包括体弱、厌食、消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大和咳嗽等症状，可初步判断。通过尸体剖检，病理组织学检查及细菌学技术可确诊，但不能用于大规模的牛结核病的流行病学调查。皮内变态反应是普查牛结核使用最为广泛的方法，该法价格低廉，但缺乏敏感性和特异性。ɣ—干扰素方法是近20年来评价为最敏感，最特异的牛结核病诊断方法，已经得到全世界的认可，在OIE手册上也是作为皮内变态反应的替代或平行试验[16]。

本研究首先对青岛瑞尔生物技术有限公司研发的牛ɣ—干扰素试剂盒与prionics的试剂盒进行了对比研究。对147份经验证或多次试验证明为阳性或阴性的样品进行检测，国产试剂盒与prionics的试剂盒表现出了高度的一致性。对12份阳性样品的检测，结果11份阳性，对30份两次变态反应均为阳性的样品检测，结果29份阳性，试剂盒的敏感性为95.2%。对105份连续3年检测为阴性的牛全血刺激培养，结果均为阴性，相对特异性为100%。与瑞士Prionics试剂盒的符合率为99.3%。分析ɣ—干扰素检测阴性的阳性样品，发现牛型和禽型PPD刺激的结果OD值均比较高，因此我们分析可能为混合感染，这与Amadori[13]的研究结果相似，遗憾的是我们并未分离非结核分枝杆菌。鉴于此种情况，我们可适当地调整判定标准，当牛型和禽型OD值远远大于阴性对照，但牛型—禽型≤0.1时，可判定牛型＞禽型为阳性，或为混合感染。总体而言，国产试剂盒具有很高的敏感性，特异性，完全能够满足检测的需求。

本研究中对皮肤试验阳性的138头奶牛，105头可疑奶牛和阴性的175头奶牛共418头用ɣ—干扰素试验检测，其中阳性74头。若将禽型OD—牛型OD＞0且牛型OD值-PBS值≥0.1判为禽型感染，则禽阳性为27头。皮内变态反应阳性牛有超过一半ɣ—干扰素试验检测为阴性。其中皮内变态反应阴性和可疑牛中也有部分牛ɣ—干扰素试验检测为阳性。不考虑皮肤试验可疑的情况（视为阴性），ɣ—干扰素禽阳性视为阴性，总体的ɣ—干扰素阳性数量低于皮内变态反应试验的阳性数量，这与张喜悦[17]之前的研究非常吻合，与wood的研究结果也是一致的。但在一些国家的研究中得出了相反的结果，ɣ—干扰素的阳性率高于皮肤试验（Neill等，Domingo等，O.R. GonzaÂlez Llamazares等[18-19]）。这可能是由于感染流行情况不同造成的。

从检测数据可以看出部分皮内变态阳性牛呈现出假阳性结果，这主要是由于皮内变态反应所应用的免疫学诊断试剂结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）是多种抗原的混合物，所含的抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及BCG所共有，由于交叉反应的存在，其非特异性的存在在所难免；若单独用该方法检出的PPD阳性牛既实行“检疫—扑杀”策略，势必误杀部分假阳性牛；同时该法敏感性较低，而且与感染动物接触的单位个体会出现假阳性反应，又因为在疫病早期阶段和急性感染病例会发生假阴性反应，这样又可能忽略部分感染牛。

IFN-ɣ试验的应用也受到一定的限制，该法基于结核分枝杆菌细胞免疫原理，需要活的淋巴细胞，必须在采血后8小时内培养，且需要有关的仪器设备并要求在实验室内进行，对基层牛场的使用有所限制，所以通常将其作为皮内变态反应的辅助试验，对皮内变态反应检出的阳性和可疑的牛进行复检。该法对皮内变态试验后2—28天内进行检测其敏感性和特异性不受影响，采样后48h内即可出结果，对牛结核病的确诊和流行病学调查提供了新的方法。此外，限制该法在国内推广的另一主要原因在于其价格昂贵，国外试剂盒检测单份样品的价格高达120余元，对于我国大规模用于检疫难以实现。因此，国产试剂盒的诞生在很大程度上弥补了这一缺陷。

[1] 何昭阳. 牛结核病研究进展[J].预防兽医学进展，2001，3（4）：34-39.

[2] 马玙，端木宏谨. 结核病[M].北京：人民卫生出版社，2006：34-35.

[3] Rothel J S， Jones S L， Corner L A. A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-ɣ and its use for the detection of tuberculosis in cattle[J].Australian Veterinary Journal.1990，67（4）：134-137.

[4] Whipple D L， A.Bolin A J， Davis J L， et al.Comparison of the sensitivity of the caudal fold skin test and a commercial gamma-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis. Am. [J]. Vet Res， 1995，56：415-419.

[5] P R W ， L A Corner ， P Plackett. Development of a simple， rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of gamma interferon [J]. Research in veterinary science，1990 ， 49 （1）： 46-49.

[6] Scacchia M， Lelli R. Evaluation of new and standardized diagnostic tests for surveillance in the fi nal part of eradication program for bovine tuberculosis[J].Veterinary Italiana.1996，32（22）：51-56.

[7] Nelson A M. The cost of disease eradication： smallpox and bovine tuberculosis[J].Annals of the New York Academy of Science.1999，894： 83-91.

[8] Emmerzaal A， Deleu S. Cattle tuberculosis： caused by Mycobacterium bovine]is difficult to detect and to treat [J]. Veehouderen Dierenarts.2000，14（2）： 4-7.

[9] Rua-Domenech R A， Goodchild T. Antemortem diagnosis of tuberculosis in cattle： a review of the tuberculin tests， gammainterferon assay and other ancillary diagnostic techniques [J]. Res Vet Sci，2006， 81（2）：190-210.

[10] Michel D D， Neil W ， Allison R. M， et al. Enhancement of the Sensitivity of the Whole-Blood Gamma Interferon Assay for Diagnosis of Mycobacterium bovis Infections in Cattle [J]. Clinical and Vaccine Immunology，2007， 14（11）：1483-1489.

[11] Wood P R， Rothel J S.In vitro：mmunodiagnostic assay for bovine tuberculosis[J]. Vet Microbiol，1994（40）135-135.

[12] Ryan T J， Buddle B M， De Lisle G W. An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing [J] . Research in veterinary science，2000 ， 69 （ 1 ） ： 57 - 61.

[13] Wood P R，Corenr L A，Rothel J S， et al. Field comparison of the interferon - gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis [J] . Australian Veterinary Journal，1991 ， 68 （ 9 ） ： 286 - 290.

[14] 胡文婷，曹瑞，张旭霞，等. 牛结核ɣ—干扰素ELISA检测方法的建立及应用[J]. 中国预防兽医学报， 2011（2）：38-40.

[15] Sun Z G， Cao R， Tian M. Evaluation of Spoligotyping and MIRU - VNTR for Mycobacterium bovis in Xinjiang ， China [J] . Research in veterinary science， 2012 ， 92（2）：236 -239.

[16] Amadori M ， Tagliabue S ， Lauzi S .Diagnosis of Mycobacterium bovis infection in calves sensitized by mycobacteria of the avium / intracellulare group [J] . Journal of veterinary medicine. B Infectious diseases and veterinary public health，2002 ， 49 （2）：89 -96.

[17] 张喜悦，呼西旦，杨经纬，等. ɣ—干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用研究[J]. 中国人兽共患病杂志. 2010，26（1）.：34-35.

[18] Neill S D， Cassidy J， Hanna J，et al. Detection of Mycobacterium bovis infections in skin test-negative cattle with an assay for bovine interferon-gamma[J]. Vet Record， 1994，135（6）： 134-135.

[19] Domingom E， Liebana J， Carre， Vila J， et al. Eficacla comparauva de la intradermorreaccion y de la pmeba de liberation de gama-interferon para el dlagnosuco de la tuberculosis bovina en una prueba de campo[J]. Med Vet，2002，12：307-317.

生猪屠宰监督管理职责已全部划入农业部

中国兽医信息网 近日，商务部与农业部完成了生猪屠宰监督管理职责移交工作。根据第十二届全国人大一次会议表决通过的《国务院机构改革和职能转变方案》（简称《方案》）和中央编办有关文件，商务部的生猪屠宰监督管理职责划入农业部，包括起草相关法律法规草案，制定配套规章、规范；制定行业发展规划；负责行业统计；负责屠宰环节质量安全监督管理，组织开展监督检查、技术鉴定等活动。近日，商务部与农业部完成了生猪屠宰监督管理职责移交工作。

农业和食品安全方面的专家分析，生猪饲养、屠宰、肉品流通和质量监管等分属商务、卫生、农业、工商、食品、质量等多个部门管理，责任不清，执行力分散，此次调整或有助于类似”八个部门管不好一头猪”顽疾的解决。

The Application of Gamma Interferon ELISA in Bovine Tuberculosis Detection

Zhou Peixiao1， Li Jing2， Zhang Luan2， Li Jie2， Cao Rui3， Zhang Xiyue4， Li Yan2
（1.The 8 Division Vet station of Xinjiang Production and Construction Corps，Shi Hezi 832000； 2.Xinjiang Production and ConstructionCorps Animal Husbandry and Veterinary Station，Urumqi 830063； 3.Qingdao Real BIOTechnology Co.，Ltd， Qing Dao 266100； 4. China Animal Health and Epidemiology Center， Qing Dao 266109）

In order to evaluate the effectiveness of gamma interferon test to detect bovine tuberculosis and the detection effect of a domestic kit， a comparative study was done between Prionics kits and the domestic kits using 42 positive samples and 105 negative samples. Then 3000 cattle from fi ve intensive farms were fi rst tested with single skin test， and 3 days later， 418 cattle including skin test positive and suspicious ones and some negative ones were tested with gamma interferon test. Results showed that the sensitivity and specif i city of the domestic kit were 95.2% and 100% respectively. and the coincidence was 99.3% with the Prionics kit，suggesting that the gamma interferon test was accurate and reliable for detection of bovine tuberculosis， and the domestic kit was as good as the Prionics kit. There were 138 skin test positive cattle and 105 suspicious cattle from 3000 tested cattle. In gamma interferon test， 74 /418 cattle were detected positive， and the coincidence rate was 60.5% with skin test （suspicious cattle considered as negative）.

bovine tuberculosis；ɣ—interferon；ELISA；quarantine inspection

S858.23文献识别码：B

：1005-944X（2014）01-0067-05

李岩