荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征焦磷酸测序检测方法建立与应用

（山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002）

荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征焦磷酸测序检测方法建立与应用

王 群 ，孙 涛，郑小龙，张晓文，姜 帆，赵玉然

（山东出入境检验检疫局，山东青岛 266002）

为建立一种快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形综合征（complex vertebral malformation，CVM）的分子检测方法，根据CVM是由于SLC35A3基因第4外显子559位处发生G→T突变的遗传学基础，利用Assay Design SW软件设计了1对PCR引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析，建立焦磷酸测序检测方法。对55份进境荷斯坦奶牛血样进行检测，发现有1例为隐性基因携带者，将PCR产物进行测序，其DNA序列与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法是一种有效的新方法，可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征的检测。

脊椎畸形综合征；焦磷酸测序；荷斯坦奶牛

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒。未突变纯合子（A/A）基因材料为构建的含有部分SLC35A3基因质粒pMD-SLC35A3；CVM纯合子（a/a）基因材料为人工致突后质粒pMD-CVM；CVM携带者（A/a）基因材料为pMD-SLC35A3与pMD-CVM两者等比混合物。所有质粒均由本实验室保存。

1.1.2 样品采集。从2011—2012年山东口岸由澳大利亚进境的荷斯坦奶牛血样中随机抽取55份全血样品，于-20℃保存。

1.1.3 试剂和仪器设备。DNeasy Blood & Tissue Kit、Taq PCR Master Mix Kit、PyroMark Gold Q96 SQA Reagents（1×96）购自Qiagen公司；链霉亲和素包被磁珠购自GE Health-care BioScience AB公司；硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒、DNA Marker DL2000购自大连宝生物有限公司；其它常规化学试剂购自北京化学试剂公司。

Sigma1-15普通离心机，Sigma公司产品；Mini-SUB凝胶电泳装置，Bio-Rad公司；Gel-Doc2000凝胶成像分析系统，Bio-Rad公司产品；PYROMARK ID定量遗传分析系统，Qiagen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 相关基因的生物信息学分析及测序引物的设计。查询Genbank中登录号AY160683的牛SLC35A3全基因序列，根据CVM致病的遗传学基础，将致病的位点第4外显子559位处碱基作为目的核苷酸序列，通过 Assay Design SW 软件设计PCR扩增引物和测序引物。表1中目的核苷酸序列中斜线两侧的黑体碱基表示同位点碱基可能突变情况。

表1引物序列

1.2.2 涵盖突变核苷酸位点的基因片段的PCR扩增。分别以A/A、a/a和A/a基因材料为模板进行PCR扩增。反应体系为：2×PCR Mix 25μL，上、下游扩增引物（ 20 pmol/L）各2μL，模板 DNA 0.5μL，双蒸水补足体积至50μL。

PCR 反应条件：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸 30s，50个循环；72℃延伸10 min；4℃终止反应。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，4℃保存备用。

1.2.3 焦磷酸测序。使用50μL标记有生物素的PCR产物与200μg链霉亲和素包被的磁珠，在室温25℃下孵育20min。用vacuum prep tool将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在70%乙醇中清洗5s；变性缓冲液洗5s；最后移到清洗缓冲液中清洗10s；vaccum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2min，再冷却到室温。此时将分离的单链 DNA 上机使用SNP检测方法进行检测。

1.2.4 重复性试验。对三种基因型的基因材料进行焦磷酸测序重复试验，分别各重复3次，对结果进行统计分析。

1.2.5 方法的应用。对山东地区进境的荷斯坦奶牛55份全血样品提取基因组，按照所建立的方法先进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。然后进行PCR产物的单链分离，上机检测。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果

根据Assay Design SW 软件设计的扩增引物扩增目的片段长度为126bp，经过摸索，PCR扩增条件及体系如1.2中所描述，PCR产物进行琼脂糖凝胶检测，大小与目的条带一致，特异性良好。

图1 PCR扩增产物电泳图

2.2 焦磷酸测序

测序片段经过单链分离纯化后经过PyroMark ID系统测序能够检测出片段的DNA序列，按照已知的基因片段的序列，可以迅速识别所测的基因型，三种基因型的测序结果如图2所示。

2.3 重复性试验

在一周的时间内对三种不同基因型的基因材料进行3次SNP检测，检测结果与已知基因型一致。测序结果与序列核苷酸同源性达到100%，3次检测结果之间的CV值小于5%，该方法具有很好的重复性。

2.4 方法的应用

55份样品PCR扩增均得到单一的大小正确的电泳条带，利用设计的的焦磷酸测序引物进行SNP检测，发现了1份A/a基因型的样品，将样品PCR产物送去测序结果与检测结果一致（图3）。

3 讨论

CVM是一种常染色体隐性遗传病，经过患牛的系谱追踪发现，该突变基因来源于美国的著名公牛Carlin-MIvanhoe Bell（1667366）及其父亲Pen-state Ivanhoe Star（1441440），基因分型显示，它们都是CVM的杂合子，由于其具有优良的生产性能，因此其精子被广泛应用于全球的奶牛育种业，从而也造成了有害基因的广泛传播[10-11]。

我国每年从澳大利亚进口牛数万头，同时也从国外进口优良牛精液进行育种，如果母牛是CVM的携带者，其后代公牛也有可能成为CVM的携带者，如果这样的携带者被培育为种公牛，那么Bell的“故事”将再次上演。因此，我们不仅需要对育种公牛进行筛查，同时对于育种母牛也需要对其基因型进行鉴定，尽量排除CVM携带者作为母本的可能，将CVM的传播从根源进行控制。

图2.三种基因型焦磷酸测序结果

表2三种基因型基因材料检测结果重复性比较

图3 CVM携带者焦磷酸测序及测序结果

本研究根据CVM的遗传学基础，建

立了焦磷酸测序技术应用于CVM检测的方法。该方法不同于Sugar法测序，具有无需制胶、无需毛细管、无需荧光染料和同位素的优点，同时它还具有高通量、实验设计灵活、序列分析简单、结果准确可靠等优点[12-13]。该方法操作简便，可以用于对CVM不同基因型进行检测。同时方法具有很好的重复性，可以应用于CVM基因型分型、携带者筛查及奶牛育种工作中。

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Development and Application of Pyrosequencing for Detecting Holstein Bovine Complex Vertebral Malformation

Wang Qun，Sun Tao，Zheng Xiaolong，Zhang Xiaowen，Jiang Fang，Zhao YuRan

（Shandong Exit and Entry Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002）

To develop a rapid and high-flux molecular method for detection of complex vertebral malformation（CVM），one pair of PCR primers and one sequencing primer were designed according to the gene sequence of bovine SLC35A3 gene by the Assay Design SW software. The PCR products of three different genotypes were detected via pyrosequencing method. There was one CVM carrier detected in 55 blood samples from imported Holstein bovine population. The pyrosequencing result was conf rmed by sequencing of PCR product of the CVM carrier.

CVM；pyrosequencing；Holstein bovine

S858.23；Q7

：A

：1005-944X（2014）10-0070-04

本课题为国家质检总局科技项目（2012IK016）

脊柱畸形综合征（complex vertebral malformation，CVM）是奶牛的一种常染色体隐形遗传性疾病。该病2000年由丹麦学者Agerholm首次报道[1]，随后在全球其他国家也相继有所报道[2-4]。Thomsen等证实了牛CVM 是由于编码UDP-N-乙酰葡糖胺载体的溶质转运家族35-3（solute carrier family 35 member 3，SLC35A3）基因的第4外显子559位处碱基发生G→T突变，导致编码蛋白的180位处缬氨酸置换为苯丙氨酸，致使异常的核苷酸糖转运到高尔基体[6]。CVM的主要临床表现为早产、死胎及多见于妊娠260天前的流产，对奶牛的繁殖性状、返情率等有较严重的影响。CVM的出生率很低，出生的患病犊牛脊椎弯曲畸形，成活率为零[7]。由于该病隐性缺陷基因携带者不表现任何临床症状，隐形缺陷基因可遗传给子代个体，只有当子代出现隐形纯合子时才会被发现并淘汰，这将会给奶牛业的发展造成巨大的损失，同时也不利于奶牛育种的发展。

目前，国际上许多国家已经开始进行奶牛中CVM携带者的筛查工作，主要检测方法为ASPCR、PCR-SSCP和基因测序[6-9]，这些方法不适合大规模批量检测，本研究利用PCR-焦磷酸测序技术，拟建立一种快速高通量检测CVM的方法。