奶牛隐性乳房炎诊断液中阴离子活性物的含量测定

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050）

奶牛隐性乳房炎诊断液中阴离子活性物的含量测定

李新圃，罗金印，李宏胜，杨 峰

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050）

【目的】以含量测定为重点，开展奶牛隐性乳房炎诊断液的质量标准研究，为规范诊断液的技术标准提供参考。【方法】建立直接两相滴定法测定奶牛隐性乳房炎诊断液中的阴离子活性物含量，并以诊断液LMT为例，进行方法的准确度、精密度和专属性评价。【结果】准确度分析结果显示，RE为-0.86%（-3.88%～3.06%）；精密度分析结果显示，日内RSD为0.57%～3.14%，日间RSD为2.19%；专属性分析结果显示，LMT中的辅料成分不影响阴离子活性物的测定。直接两相滴定法测定LMT中的阴离子活性物，具备必要的准确度、精密度和专属性。【结论】因为无论是组成还是技术，LMT均能代表同类的诊断液，所以直接两相滴定法可作为奶牛隐性乳房炎诊断液的含量测定方法。

奶牛隐性乳房炎诊断液；阴离子活性物；表面活性剂；含量测定

奶牛乳房炎是一种影响奶牛业发展的常见普通病，尤其是隐性乳房炎，发病率极高[1-3]，我国奶牛隐性乳房炎的平均头发病率在50%左右[4-5]。隐性乳房炎可降低奶产量，使奶牛的年生产能力降低10 %左右；降低乳品质量，使乳汁中氨基酸总量降低21%左右；致使乳汁中病原微生物的检出率明显升高[6-8]，危害消费者身体健康。由于患隐性乳房炎的乳房和乳汁均无肉眼可观察到的病理变化，临床上常被忽视，不仅造成乳产量和质量的下降，而且造成致病菌的扩散和传播，危害极大[9-10]。对于奶牛隐性乳房炎的防控，国内外均主张采用常规诊断与综合防治相结合的防控措施[11-13]。目前临床常用的奶牛隐性乳房炎诊断液，是一种以阴离子表面活性剂为主要成份的体外诊断试剂[14]。对于体外诊断试剂，欧美及我国卫生部均将其纳入医疗器械管理范围，但我国的兽用医疗器械还没有实施有效的管理制度[15]，因此奶牛隐性乳房炎诊断液尚无有效的管理办法和质量、技术标准，不仅影响了诊断液的市场发展，也妨碍了奶牛隐性乳房炎防控措施的有效实施。目前，国内外常见的奶牛隐性乳房炎诊断液CMT、LMT、BMT等，其主要成份均是以十二烷基硫酸钠（SDS）和十二烷基苯磺酸钠（LAS）为主的阴离子表面活性剂。本试验以阴离子活性物含量测定为重点，开展奶牛隐性乳房炎诊断液的质量标准研究，为规范诊断液的技术标准提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂。三氯甲烷、硫酸、氢氧化钠、95%乙醇为国产分析纯试剂。十二烷基硫酸钠（≥99%）、氯化苄苏鎓（海明1622，≥99%）、溴化底米鎓（95%）、酸性蓝-1（=50%）为Sigma产品；分析中使用的水均为蒸馏水。

1.1.2 试样。十二烷基硫酸钠（SDS，上海白猫股份有限公司生产，阴离子活性物含量≥90%）；十二烷基苯磺酸钠（LAS，江苏清婷洗涤品有限公司生产，阴离子活性物含量≥90%）；乙氧基化烷基硫酸钠（AES，临沂绿森化工有限公司生产，阴离子活性物含量≥69%）；S+L+A（SDS、LAS、 AES的混合物，其摩尔比为1：1：1）；奶牛隐性乳房炎诊断液LMT（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所生产，阴离子活性物含量为0.8 mol/L）。

1.2 方法[16]

1.2.1 标准溶液及指示剂。按照 GB/T 5173-1995（表面活性剂和洗涤剂/阴离子活性物的测定-直接两相滴定法），制备0.004 mol/L氯化苄苏鎓标准溶液和酸性混合指示剂。

1.2.2 直接两相滴定法测定阴离子活性物含量。称取阴离子活性物为4mmol的试样，用适量水溶解，再用0.5mol/L的氢氧化钠或硫酸溶液调pH在7.5～9.5之间，然后用水稀释至1000mL，使阴离子活性物含量约为0.004mol/L，准确移取25mL于具塞三角烧瓶中，加入10mL水，15mL氯仿和10mL酸性混合指示剂，用0.004 mol/L氯化苄苏鎓标准溶液滴定至终点。滴定过程充分震摇，滴至乳状液破乳，三氯甲烷层红色退去，变为浅灰蓝色。1mL 0.004 mol/L阴离子活性物相当于1mL 0.004 mol/L氯化苄苏鎓。

1.3 方法评价[17]

1.3.1 准确度。以LMT为例，进行方法评价。制备阴离子活性物含量分别为0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L的LMT试样，作为真值，每个含量的试样各取3份，按1.2.2的方法测定阴离子活性物含量，作为测定值，计算相对误差（RE）。

1.3.2 精密度。在一个工作日内，按1.3.1的方法，制备LMT试样及测定阴离子活性物含量，计算相对标准偏差RSD，进行日内分析；连续5个工作日，每个工作日分别按上法制备LMT试样及测定阴离子活性物含量，计算日间RSD，进行日间分析。专属性制备不含阴离子活性物的LMT空白试样，测定阴离子活性物含量。

2 结果

2.1 试样中的阴离子活性物含量

采用直接两相滴定法，测定SDS、LAS、AES、S+L+A及LMT的阴离子活性物含量，结果见表1。计算过程中，SDS、LAS和AES的分子量采用平均相对分子量（依照国标法 GB/T 13530.3计算）。每个试样制备5份（n=5），分析结果的

相对误差RE在-2.37%～2.50%范围内，相对标准偏差RSD在0.63%～3.87%范围内。

表1试样中的阴离子活性物含量

2.2 方法的准确度及精密度

直接两相滴定法测定LMT中的阴离子活性物，准确度和精密度分析结果见表2和表3。表示准确度的RE值为-0.86（-3.88～3.06%）。表示精密度的日内RSD为0.57～3.14%，日间RSD为2.19%。专属性试验结果显示，不含阴离子表面活性剂的LMT试样，检测不到阴离子活性物，说明LMT中的辅料成分对测定结果没有影响。因此，本方法测定LMT及其相关的阴离子表面活性剂具备必要的准确度、精密度和专属性。

表2方法的准确度

表3方法的精密度

3 讨论

奶牛隐性乳房炎诊断液中的主要成分是以SDS和LAS为主的阴离子表面活性剂。研究发现，在奶牛隐性乳房炎诊断液中可以使用的阴离子表面活性剂选择范围较广，除了SDS和LAS，还可以使用AES、LASH等，并且混合使用也不影响诊断液的诊断结果。本试验的结果显示，直接两相滴定法测定阴离子表面活性剂的范围较广，不仅可以测定SDS、LAS、AES等，还可以测定它们的混合物S+L+A，因此非常适合奶牛隐性乳房炎诊断液中阴离子活性物的含量测定。

目前全世界广泛使用的奶牛隐性乳房炎诊断液是CMT，而LMT是参考CMT技术研发的第一个国产诊断液，其它国产诊断液均是在CMT和LMT技术的基础上开发的同类产品，无论是组成配方还是诊断方法，LMT均具有一定的代表性。因此，本实验建立的直接两相滴定法并不限于LMT的阴离子活性物含量测定，也可以用于同类诊断液的含量测定。

与一般化合物含量测定概念不同的是，阴离子表面活性剂多为混合结构，因此，用于奶牛隐性乳房炎诊断液中阴离子活性物的含量测定方法，其灵敏度并不是越高越好，而是在一定的范围内才能客观反映诊断液质量。阴离子表面活性剂（阴离子活性物）含量测定方法的报道很多[18]，但通过对高效液相色谱法、季铵盐-溴甲酚紫分光光度法和直接两相滴定法进行对比试验，发现高效液相色谱法的灵敏度较高，不适合用于诊断液的含量测定，季铵盐-溴甲酚紫分光光度法影响因素很多，很难掌控合适的测试条件，而直接两相滴定法测定奶牛隐性乳房炎诊断液的代表产品LMT，具备必要的准确度、精密度和专属性，因此不仅适合作为LMT的含量测定方法，也适合作为同类诊断液的含量测定方法。

随着我国奶牛业的发展和乳品质量标准的提高，奶牛乳房炎的防控显得越来越重要，而乳房炎诊断液在乳房炎防控中发挥着非常重要的作用。由于目前奶牛隐性乳房炎诊断液尚无有效的管理办

法，因此开展质量标准研究，不仅有助于诊断液的市场化发展，而且有利于进一步规范诊断液的技术标准。

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Content Determination of Anionic Active Matter in Diagnostic Reagent for Subclinical Mastitis in Dairy Cow

Li Xinpu，Luo Jinyin，Li Hongsheng，Yang Feng

（Key Laboratory of New Animal Drug Project，Gansu Province / Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development，Ministry of Agriculture / Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou 730050）

ObjectiveThe quality standard of diagnostic reagent for subclinical mastitis in dairy cow was studied，with particular emphasis on content determination in order to regulate the technology standard of the diagnostic reagents.MethodDirect two-phase titration method was developed to determinate the anionic active matter in diagnostic reagents for subclinical mastitis in dairy cow. Taking the diagnostic reagent LMT as an example，its accuracy，precision and specificity were evaluated.ResultAccuracy analysis showed that the RE was -0.86%（-3.88～3.06%）. Precision analysis showed that intra-day RSD and inter-day RSD were 0.57～3.14% and 2.19% respectively. Specif city analysis showed that the result was not affected by other accessory ingredients in LMT. Direct two-phase titration method was developed to determine anionic active matter in LMT with necessary accuracy，precision and specif city.ConclusionBecause LMT is representative both in composition and technology in diagnostic reagents for subclinical mastitis in dairy cows，so direct two-phase titration method could be used to content determination of the diagnostic reagents.

diagnostic reagent for subclinical mastitis in dairy cow； anionic active matter； surfactant； content determination.

S858.23

：B

：1005-944X（2014）10-0062-04

农业行业标准制定项目“奶牛隐性乳房炎快速诊断技术”（2012-285）；“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD12B03）；甘肃省农业科技创新项目（GNCX-2013-59）；甘肃省自然科学基金项目（1308RJZA119）

李新圃