提高灵芝-当归双向固态发酵基质抗氧化活性的条件优化研究

魏 龙，贠建民，艾对元，张紊玮，丁叶梅，陈 芳

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

中草药是一类潜力巨大的天然抗氧化剂资源[1]，但由于中草药发挥药效的基础成分含量低、不易合成、难以分离，且原料人工培育的成本高、周期长，无法保证市场的需求[2]。而利用微生物发酵的方法可以有效提高中草药中某一成分的含量或产生一些原中药材中不具有的活性成分，从而为中药有效化合物的获取提供了新的途径[3]。上世纪80年代末，庄毅教授提出了药用真菌双向固体发酵的概念[4]。双向固态发酵技术是指经过筛选的中药材（药性基质）和营养辅料（非药性营养基质）组成全性基质，接种单株药用真菌，通过人工控制温度、湿度等条件，基质在提供真菌生长所需要营养的同时又能被真菌的酶改变其组织成分，使药性基质原有化学成分经过生物转化作用，产生具有新的味性功能的药性菌质或全性菌质。它具有反应条件温和、区域和立体选择性强、操作简单、成本较低、公害少等优点，同时能够完成一些常规炮制方法难以实现的反应，从而获得一些结构更合理或活性更好的药物成分[5]。杨海龙、王林等利用黄芪、当归、党参、玄参粉末或其水提取物来培养灵芝，结果表明，在适宜添加量下，能有效提高灵芝多糖这类抗氧化活性物质的产生[6-7]。李赟等研究发现添加适量党参提取液能显著促进白灵菇胞内多糖、胞外多糖得率[8]。阮鸣等探索了黄芪双向固体发酵过程中黄芪甲苷的转化，结果发现黄芪甲苷经药用真菌（灵芝）双向固体发酵后发生了生物转化，这一转化具有增效作用[9]。乔英、刘建华等研究表明，灵芝（Ganoderma lucidum）具有良好的抗氧化活性[10-11]，临床上广泛应用于提高免疫力、抗肿瘤、抗癌、镇痛、保肝、增强记忆、抗菌、消炎等疾病的预防与治疗[12-15]。研究报道表明，当归（Angelicae sinensis）具有抗肿瘤、抗辐射损伤、增强免疫功能、补血、改善血液循环等功效[16-17]，而有关当归发酵产物抗氧化活性的研究报道较少。为此，本实验拟以甘肃地产当归作为主要药性基质，采用灵芝作为菌种，探索二者进行双向固体发酵的最适发酵培养基质组成和最佳发酵条件，及其对发酵产物的抗氧化活性的影响，旨在为相关中药制剂的开发提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝（Ganoderma lucidum）菌种 甘肃农业大学食品科学与工程学院微生物实验室保存；当归（Angelicae sinensis） 市售，药材级，产自甘肃岷县；麦麸、玉米芯、玉米淀粉 市售。

VU756CRT紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；THZ-8台式恒温振荡器 上海佑科仪器仪表有限公司；电热恒温培养箱 北京科伟永兴仪器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备 PDA斜面培养基，用于灵芝菌种的活化；摇瓶种子液培养基，采用玉米淀粉液体培养基，组成为：玉米淀粉30g，蔗糖20g，酵母粉5g，MgSO41g，KH2PO41.5g，VB10.1g，水1000m L。非药性基础发酵培养基配方为：玉米芯32%，麦麸为66%，MgSO40.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO41%，含水量65%。

1.2.2 菌种的活化 灵芝菌苔接种于PDA斜面培养基，28℃培养7d。待菌丝长满斜面，备用。

1.2.3 液体菌种制备 取两小块（面积1cm2）活化的斜面菌丝体，接种到装有100m L液体种子培养基的250m L三角瓶中，28℃、150r/m in培养6d，待用。

1.2.4 最适发酵培养基质的确定

1.2.4.1 当归添加量的确定 当归粉末添加量设置：在1.2.1所述非药性基础营养基质中，分别添加0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%当归粉末，控制水量65%。装入250m L三角瓶中，灭菌后以10m L/100g接种量接种灵芝种子液，在28℃培养7d，测定其抗氧化活性，确定当归添加量。

1.2.4.2 非药性营养基质中麦麸与玉米芯比例的确定 在上述已确定的当归添加量基础上，来筛选非药性营养基质中麦麸与玉米芯的比例。麦麸∶玉米芯配比设置为：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，其他条件为MgSO40.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO41%，含水量65%。通过测定发酵产物的抗氧化活性，确定基质中麦麸与玉米芯最佳配比。

1.2.5 最佳发酵条件单因素实验

1.2.5.1 接种量的确定 在1.2.4优化得到的发酵培养基中，分别接种6、8、10、12、14m L/100g灵芝种子液，28℃培养7d，测定发酵产物的抗氧化活性。

1.2.5.2 料层厚度的确定 在250m L三角瓶中分别装入1.2.4优选发酵培养基质，使料层厚度分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0cm，以筛选的最佳接种量接种，28℃培养7d，测定发酵产物的抗氧化活性。

1.2.5.3 初始pH的确定 依据上述优选条件，分别设定发酵培养基初始pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，28℃培养7d，测定发酵产物的抗氧化活性，以确定灵芝发酵当归的最适初始pH。

1.2.5.4 发酵周期的确定 依据上述优选条件进行发酵实验，28℃培养，分别在第7、9、11、13、15、17、19、21d测定发酵产物的抗氧化活性，以确定适宜发酵周期。

1.2.6 最佳发酵条件正交实验 在单因素实验的基础上，采用正交实验表L9（34）对发酵接种量、料层厚度、培养基初始pH和发酵时间进行4因素3水平的正交实验（见表1），每个实验处理进行3次重复。正交实验所得发酵产物以其DPPH自由基清除率为指标，通过对结果的极差和方差分析，确定DPPH自由基清除率高的组合为最佳发酵条件。

表1 培养条件正交实验设计Table1 Orthogonal designs of culture conditions

1.2.7 抗氧化活性的测定方法

1.2.7.1 发酵菌质的预处理 在65℃条件下将发酵菌质烘至恒重，粉碎后过40目筛，取粉末5g于三角瓶中加100m L水，室温下超声提取30m in后，70℃水浴中提取30min，4000r/m in离心10min，收集上清液，定容至100m L，备用[18]。

1.2.7.2 DPPH自由基清除率的测定 参照张汇等[19]抗氧化活性测定方法。

1.2.7.3 还原力的测定 参照曾荣耀等的方法[18]。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基中当归最适添加量对抗氧化活性的影响

高浓度的中药添加量会抑制真菌的生长[6]。因此，有必要确定双向发酵基质中当归的最适添加量。六个不同供试当归添加量对双向固态发酵产物抗氧化活性及灵芝菌丝体生长情况的影响分别见图1和表2。

从图1可以看出，随着当归添加量的增加，发酵菌质的DPPH自由基清除能力与还原力均呈先上升后下降趋势，当归添加量为15%时达到最大，DPPH自由基清除率为44.6%，OD值达到0.275，此后下降；且各梯度间差异显著。从表2可知，添加当归15%时灵芝菌丝生长状况最好，此后随着当归添加量的增加，灵芝菌丝体长势呈下降趋势，可能是由于当归中的某种药效成分对灵芝的生长抑制作用造成的。故综合以上结果，选择15%的当归粉末作为发酵基质的最适添加量。

图1 不同当归添加量对发酵产物抗氧化活性的影响Fig.1 The effectof different A.sinensis adding amounton antioxidantactivity of fermented products

2.2 发酵培养基中麦麸-玉米芯配比对抗氧化活性的影响

图2 不同麦麸玉米芯添加比例对发酵产物抗氧化活性的影响Fig.2 The effect of differentbran and corncob rate on antioxidantactivity of fermentation products

为确定非药性营养基质中麦麸与玉米芯比例，本实验设置了五个不同比例来考察其对发酵产物抗氧化活性及灵芝菌丝体生长情况的影响，结果分别见图2和表3。

从图2可以看出随着发酵基质中玉米芯添加量增大，发酵菌质的DPPH自由基清除率与还原力均随之升高，麦麸与玉米芯之比为1∶3时，到达最大值45.1%，还原力最大为0.276，此后略有下降，且各梯度间差异显著。从表3可知，在供试条件下，基质中玉米芯的添加量越大，灵芝菌丝体生长状况越好，综合以上结果，选择1∶3作为麦麸与玉米芯的最适配合比例。

2.3 提高灵芝-当归双向发酵基质抗氧化活性的最佳发酵条件筛选

2.3.1 单因素实验

2.3.1.1 最佳接种量筛选 从图3可以看出，同对照相比，随着接种量的增大，发酵菌质的DPPH自由基清除率与还原力均随之升高，当接种量为12m L/100g时，到达最大，分别为45.6%、0.284，此后二者无明显变化；且差异显著。从表4可知，随着接种量的增加，灵芝生长状况越好，当10%时达到最好，之后基本保持不变。但是，结合发酵菌质的抗氧化活性，综合以上结果选择12%作为发酵的最佳接种量。

图3 不同接种量对发酵产物抗氧化活性的影响Fig.3 The effectof different inoculum volume on antioxidant activity of fermentation products

表2 不同当归添加量对灵芝生长状况的影响Table2 The effectof different A.sinensis adding amount onmycelium growth status of G.lucidum

表4 不同接种量对灵芝生长情况的影响Table4 The effectof different inoculum volume onmycelium growth status of G.lucidum

2.3.1.2 料层厚度筛选 从图4可以看出，随着料层厚度增大，发酵菌质的DPPH自由基清除率呈先上升后下降趋势，当料层厚度为2.5cm时，到达最大为45.4%；在此条件下，还原力也达到最大，为0.280，且与其他处理间的差异显著。从表5可知，当料层厚度为2.5cm时灵芝生长状况为最好，之后随着料层厚度的增加灵芝生长状况越差，可能是由于培养基中溶氧量减少的原因造成的。结合发酵菌质的抗氧化活性，综合以上结果选择2.5cm为最佳料层添加厚度。

图4 不同料层厚度对发酵产物抗氧化活性的影响Fig.4 The effectof differentmaterial thickness on antioxidantactivity of fermentation products

图5 不同初始pH对发酵产物抗氧化活性的影响Fig.5 The effect of different initial pH on antioxidantactivity of fermentation products

2.3.1.3 最适初始pH筛选 从图5可以看出，随着初始pH的量增大，发酵菌质的DPPH自由基清除率和还原力均随之升高，当初始pH为6时，二者均到达最大，其中DPPH自由基清除率为45.1%，还原力最大为0.280；此后呈下降趋势；且差异显著。从表6可知，初始pH为6.0时灵芝生长状况达到最好，在文献报道的灵芝最适生长pH范围内。综合以上结果选择6.0作为发酵的最佳pH。

2.3.1.4 最佳发酵时间筛选 在确定了发酵接种量、料层厚度、初始pH的条件下，选取不同时间收获的发酵产物进行抗氧化比较，从而确定最佳发酵终点。从图6可知，随着发酵天数的增加，发酵菌质的抗氧化活性随之升高，其中，在第15d时到达最大，其中，DPPH自由基清除率为：47.16%、还原力为：0.293，此后基本保持不变。故选择15d为一个发酵周期。

图6 不同发酵时间对获得的发酵产物抗氧化活性的影响Fig.6 The effect of different fermentation time on antioxidantactivity of fermentation products

2.3.2 正交实验结果分析 基于单因素所得的最佳条件，采用正交表L9（34）安排正交实验，实验结果如表7。

由表7极差分析结果可知：在实验取值范围内，影响因素中对DPPH自由基清除率影响最大的是接种量，其次是料层厚度，再次是初始pH，而影响最小的是发酵时间。从极差分析表中得出最优组合为：A2B2C1D2，即接种量12%、料层厚度2.5cm、初始pH 5.5、发酵时间15d。

为检验各因素对发酵菌质清除DPPH自由基能力的影响程度，采用SPSS Statistics 21软件进行方差分析，结果见表8。

通过表8方差分析可知，接种量和料层厚度对DPPH自由基清除率有显著影响；而初始pH与发酵时间对发酵菌质清除DPPH自由基能力的影响不显著。

表5 不同料层厚度对灵芝生长情况的影响Table5 The effectof differentmaterial thickness onmycelium growth status of G.lucidum

表6 不同初始pH对灵芝生长情况的影响Table6 The effectof different initial pH onmycelium growth status of G.lucidum

由于在表7正交实验中得出的最佳发酵条件为：A2B2C3D1；而在极差分析结果中得出的最优组合为：A2B2C1D2；二者不一致，故需通过验证实验进行比较，即在接种量12%、料层厚度2.5cm、初始pH5.5、发酵时间15d的条件下发酵实验，测定DPPH自由基清除率，重复6次，结果如表9。

表7 正交实验结果及其极差分析Table7 Results of orthogonal experimentand range analysis

表8 正交实验结果的方差分析Table8 Variance analysis on the results of orthogonal experiment

表9 最优组合下发酵产物的抗氧化活性Table9 Antioxidantactivity of fermentationmedium in the optimal combination

由实验结果表9得出，在最优组合即接种量12%、料层厚度2.5cm、初始pH 5.5、发酵时间15d的条件下，DPPH自由基清除率平均值为49.03%，还原力（OD）平均值为0.298，高于在正交表组合5中得出的最高抗氧化活性。其还原力比不发酵基质提高了6.26倍。故得出最佳发酵条件为：接种量12%、料层厚度2.5cm、初始pH 5.5、发酵时间15d。

3 讨论

有关灵芝抗氧化活性的研究与应用由来已久[10-11]。灵芝作为中药材发酵菌种已成为当前研究的热点，以往研究报道表明，灵芝发酵是提高中药抗氧化活性的良好途径，发酵产物的抗氧化水平主要取决于菌株的遗传特性和培养条件[20]。

实验结果证明，采用添加当归粉末与非药性营养基质复配进行灵芝固态发酵，比不添加当归进行发酵的抗氧化活性明显增强，这与刘媛、丁重阳等添加不同中药在促进灵芝液体深层发酵方面的研究结果一致[21]。培养基质中的非药性营养基质为灵芝菌丝体的生长提供了充足的碳源、氮源等营养来源，而添加的中药材当归是提高真菌抗氧化活性的重要原因，可能是因为中药当归中的某些成分增强了灵芝菌体抗氧化相关物质的合成代谢途径；另一方面真菌生理活动使药性基质中的有效成分发生了转变，产生新的抗氧化成分，体现了灵芝-当归双向发酵的协同作用结果。而有关发酵产物抗氧化活性提高的机理，尚有待于从生理、生化及代谢产物等方面进一步研究探明，这将为中药发酵工业化生产提供一定的科学依据。

此外，本实验结果还表明，发酵基质中当归添加量在30%以上时，会严重影响灵芝菌丝体的生长，进而降低其抗氧化活性，不利于中药的发酵。这进一步证明了发酵基质中中药添加量不易过高这一结论[4，6]，但这不利于该技术的产业化推广应用。因此，如何在中药固态发酵基质中降低非药性辅料的添加量，并减轻发酵过程中药性成分对菌丝体抑制作用等问题，还有待于从药物化学方面深入研究。

4 结论

4.1 灵芝-当归双向发酵的适宜培养基质组成为：当归粉末15%、麸皮与玉米芯混合料为83%（麸皮∶玉米芯为1∶3）、MgSO40.5%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO41%。

4.2 最佳固态发酵条件为：灵芝种子液接种量12m L/100g、料层厚度2.5cm、初始pH 5.5、发酵时间15d。在该条件下，发酵产物的抗氧化活性最高，DPPH自由基清除率为49.03%、还原力比发酵前提高了6.26倍。

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