温州无偿献血人群丙肝病毒感染情况及其基因型的研究

林荣+刘燕飞+陈温茹+文金生+王彬

摘要] 目的 了解温州市无偿献血人群丙型肝炎病毒感染及其基因分型的情况。 方法 对2010年1月～2012年12月温州中心血站采集的无偿献血者血液进行丙型病毒性肝炎病毒抗体（抗-HCV）的检测，并对检验结果进行统计分析，同时采用RT巢式-PCR法，对2012年度68例HCV-IgG阳性者进行HCV-RNA的检测及基因分型。结果 温州市无偿献血者丙型肝炎病毒抗体不合格率各年份基本保持稳定，差异无统计学意义（P<0.05）；而68例抗-HCV阳性标本的基因分型结果显示，2a单阳性为4.41%，1b单阳性为30.88%，1b和2a双阳性为60.29%，1b总阳性率为91.18%，2a总阳性率为 64.71%。 结论 温州市无偿献血者HCV感染率不高，总体趋稳，所感染的HCV基因型以1b型占优势，并且基因型1b和2a混合感染率较高。

[关键词] 献血者；丙型肝炎病毒；感染率；聚合酶链反应；基因分型

[中图分类号] R512.6；R457.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）02-0151-03

Study on the infection of hepatitis C virus and its genotypes among voluntary blood donors in Wenzhou

LIN Rong1 LIU Yanfei1 CHEN Wenru1 WEN Jinsheng2 WANG Bin1

1.Wenzhou City Central Blood Center，Wenzhou 325001，China； 2.Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the infection of HCV and investigate the feature of HCV genotypes among voluntary blood donors in WenZhou. Methods The results of HCV-IgG by ELISA among voluntary blood donors in wenzhou from 2010 to 2012 were statistically analyzed and HCV genotyping was performed using RT- PCR. Results The unqualified rate for anti-HCV was not obviously different year by year（P<0.05）. Among 68 subjects， the percentage of genotype 2a single positive was 4.41%， the percentage of genotype 2b single positive was 30.88%， the percentage of genotype 2b and 2a double postive was 60.29%， the percentage of total 1b infection was 91.18%， the percentage of total 2a infection was 64.71%. Conclusion The unqualified rate of HCV is not obviously different every year. There are genotype 1b and 2a in Wenzhou， while 1b genotype is the majority， and the rate of 1b and 2a co-infection is high.

[Key words] Voluntary blood donor；Hepatitis C virus； Infection rate； Polymerase chain reaction； Genotype

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是丙型肝炎的病原体，人感染丙肝病毒后比感染乙肝病毒更容易转化成慢性肝炎，并可能发展成肝硬化和肝癌，而且病毒主要通过血液传播，是导致输血后肝炎的主要病原体，因此血站作为临床用血提供部门做好血液的筛查就显得十分重要。因为丙肝病毒基因组具有异源性和高度可变性，所以在长期演化过程中丙肝病毒可产生众多的变异毒株（基因型） 和病毒基因型，具有在人群分布显著差异的特点。目前尚无温州地区无偿献血者丙肝感染基因型的报道。本研究采用ELISA方法对采集的血液标本进行抗HCV检测，通过分析得出献血群体中HCV的感染情况，并且通过RT-巢式PCR技术进行HCV基因分型的研究，以探讨温州无偿献血群体HCV基因型的分布特征。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2010年1月～2012年12月温州中心血站采集的所有无偿献血者的血液标本。献血者来自社会各界，符合《献血者健康检查要求》。并对2012年度的68例抗-HCV 阳性血清标本进行HCV基因分型，抽取献血袋待测管中血液5 mL，立即于-80℃保存，备用。

1.2 材料和试剂

HCV抗体诊断试剂盒购自上海科华生物技术公司；全血RNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；RNA酶抑制剂、Taq酶、dNTP混合物、DEPC、引物、Marker等购自上海捷瑞生物工程有限公司；M-MuLV逆转录酶购自Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 HCV抗体的检测 采用ELISA法，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，结果由仪器自动判读。endprint

1.3.2 RT-巢式PCR检测HCV-RNA和基因分型 具体操作参照okamoto法[1]进行。主要步骤为：提取血清总RNA；逆转录合成cDNA，以HCVCore基因区分型PcR引物（引物序列见表1）行套式PCR扩增，两轮PCR 反应体系和反应条件相同。反应体系：10 倍稀释的PCR 缓冲液3 μL，2.5 mmol/L，dNTP 2 μL，dH2O 20.6 μL，上、下游引物各1.5 μL，Taq 酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，共计30 μL；反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 min，72℃延伸30 s，35 个循环，72℃延伸10 min。以聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR终产物。

表1 HCV-RNA基因分型所用引物

2 结果

2.1 2010～2012年度温州市无偿献血血液检测抗-HCV 不合格率情况

2010～2012年度温州市无偿献血者血液抗-HCV检测不合格率见表2，丙肝病毒的感染情况总体趋稳，各年份变化不大，但相比湖南岳阳市2006～2010年[2]、深圳市宝安区2004～2011年[3]报道的平均不合格率低。

表2 2010～2012年度温州市无偿献血者血液抗-HCV检测不合格率

注：*与2012年比较，**与2010年比较，#与2011年比较

2.2 RT-巢式PCR检测HCV-RNA结果（图1）

PCR产物长度为144 bp对应基因型为1b，PCR产物长度为174 bp对应基因型为2a，PCR产物长度为144 bp和174 bp则对应基因型1b、2a。

图1 HCV基因型分型结果，A为1b阳性（144bp），2a阴性，B为1b阴性，2a阳性（174bp），C为1b阳性（144bp），2a阳性（174bp）

2.3 HCV-RNA基因分型结果

在所检测的68例标本中基因型1b占30.88%，基因型2a占4.41%，基因型1b和2a占 60.29%，1b总阳性率为91.18%，2a总阳性率为64.71%，未检出1a和2b基因型。

3 讨论

丙型肝炎病毒是一种常见的肝炎病毒，主要是通过血液传播导致机体感染，是最常见的引起输血后肝炎的病原体[4-5]。因其传播与血液有关，而且国内外的采血站都有过丙型肝炎（HCV）爆发的报道[6-9]，所以血站是防控丙肝的重点区域，献血人群是重要的监控群体。目前人群中丙型肝炎病毒的感染状况主要根据血清抗-HCV阳性的高低来衡量[10]。本研究表明温州无偿献血群体抗-HCV检测平均不合格率为0.223%，且逐年变化不大，但低于岳阳、深圳等国内其它城市的报道[2，3]。由于血清抗-HCV阳性是造成血站血液报废的原因之一，所以应制定更为严格的献血者血液检验标准，采用如PCR等更加可靠的方法，提高HCV感染的早期检出率，以减少不必要血液报废。

由于输血传播是引起丙肝的主要原因，故了解无偿献血者感染的丙肝病毒基因类型对于了解整个地区的病毒感染情况有重要的意义。丙肝病毒的基因分型通常按照Simmonds等[11]将HCV 基因分为1～6 型，不同基因型或基因亚型的丙肝患者，在临床表现以及治疗方面均有差异，在治疗之前进行HCV 基因分型对判定治疗难易程度及制定治疗方案等非常有帮助[12-13]。已有研究表明在我国南方沿海城市丙肝病毒基因型主要以1b型为主，大概占90%以上；而在我国北方城市其基因型主要是2a型，大概占46%～70%[14]。而目前温州地区无偿献血群体HCV基因型分布的情况还没有相关的研究报道。因此，本研究以无偿献血群体为研究对象，通过RT-PCR的方法对无偿献血者抗-HCV阳性的血液标本做了基因分型的检测，结果表明无偿献血群体HCV感染者中1b基因型的比率高于2a基因型，而且1b和2a混合感染者的比率（60.29%）也极高，1b总阳性率高达91.18%，2a总阳性率为64.71%，但是未检测到1a和2b基因型，与文金生等报道的比例相似[15]。无偿献血者所感染的HCV 基因型分布情况和输血后丙型肝炎患者基因型分布情况非常相近，两者之间差异无显著性，提示献血群体HCV 感染者是输血后丙型肝炎的主要传染源，这也进一步说明加强献血者筛选、排除HCV 感染者在控制丙肝传播中的重要性。

总之，本研究一定程度上反映了本地区献血群体HCV感染及病毒基因分型情况。为了消除因病例少造成的影响，在今后的研究中，将继续选取标本来研究本地区HCV基因型分布特征。

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（收稿日期：2013-08-29）endprint