微小RNA与甲状腺癌的关系及其研究进展

戴文斌

广西壮族自治区柳州市人民医院病理科，广西柳州 545006

甲状腺癌是常见的内分泌腺恶性肿瘤，占癌症发病率的2.59%，包括甲状腺乳头状癌（PTC），甲状腺滤泡癌（FTC）、甲状腺未分化癌（ATC）和甲状腺髓样癌（MTC），前三者起源于滤泡上皮细胞，后者起源于滤泡旁细胞，其中PTC约占甲状腺癌的80%。目前，甲状腺癌的发病机制尚未清楚，通过对甲状腺癌病因及发生发展机制的研究，对于提高其诊断率、指导治疗及改善预后具有重要的临床意义。miRNA是一类广泛存在于真核细胞中的长约22 nt的单链、非蛋白编码RNA，能对基因表达进行负调控，进而调节细胞分化、生长、增殖、代谢和凋亡等基本的生理过程。近年的研究发现，miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。本文就miRNA与甲状腺癌相关的研究进展做一综述。

1 miRNA的生物合成及作用机制

1.1 miRNA的生物合成

miRNA由不同的染色体位点转录而成，定位于独立的非编码RNA或蛋白编码基因的内显子。miRNA生物合成和成熟过程如下：miRNA基因在细胞核内经RNA聚合酶Ⅱ的参与下转录生成初始 miRNA（pri-miRNA），后者在细胞核中被RNA酶Ⅲ Drosha-DGCR复合体切割，形成60～70个nt的 5′端含有磷酸基，3′端有二核苷酸突出的发夹状前体 miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA在 RAN.GTP依赖的外运蛋白-5（exportin-5）的转运下输送到胞质中。最后，酶Dicer将pre-miRNA切割成约 20 bp的双链RNA，后经解旋酶的作用，产生两条成熟的单链 miRNA，其中5′末端自由能较低的一条单链miRNA被整合到miRNA介导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complexes，miRISC）中，形成非对称 RISC复合物（asymmetric RISC assembly），作为成熟的miRNA发挥作用，而另一条链降解[1]。

1.2 miRNA的作用机制

miRNA是通过与靶基因的结合，调节靶基因mRNA降解或转录后翻译的抑制而发挥作用。主要通过以下三种作用模式与靶基因结合[2]：第一种作用时与靶基因 mRNA3′-UTR进行不完全的碱基配对，形成多个不完全结合位点，调节靶基因转录后翻译的抑制，抑制蛋白的合成，这种方式目前发现最多，如lin-4。第二种以miR-171为代表，作用时与靶基因mRNA形成完全或近似完全配对，通过RNAi的机制降解mRNA。第三种以let-7为代表，它具有以上两种作用模式，当与靶基因完全互补结合时，通过RNAi的机制降解mRNA，当与靶基因不完全互补结合时，抑制蛋白的合成，负性调控靶基因的表达。迄今为止，人类基因组可能存有1000多种miRNA基因，目前已被证实的miRNA有700多个，一个miRNA可作用于多个靶基因，甚至能同时调节上百个基因，发挥巨大的调控功能。

2 miRNA与肿瘤的关系

近年来，miRNA介导的转录后基因沉默（PTGS）与肿瘤形成的相关性已成为关注的热点。主要表现在：首先miRNA参与了细胞分化、增殖、代谢、凋亡、细胞周期等过程；其次miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在，超过一半的miRNA位于或靠近肿瘤相关基因组的区域和脆性位点、杂合型丢失区、扩增区或断裂点区，即经常发生缺失、扩增、易位的染色体片段。再次miRNA在多种肿瘤细胞中的异常表达；最后miRNA前体上的突变或多态影响miRNA的加工成熟和癌的易感性，这些都提示miRNA与肿瘤密切相关[3]。miRNA广泛参与机体生长、发育和疾病发生发展等生命过程，与乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、子宫内膜癌及前列腺癌等[4-9]多种肿瘤的发生发展密切相关。

3 miRNA与甲状腺癌的关系

近年来，众多学者研究认为多种miRNA与甲状腺癌的发生、发展、转移及预后有重要关系[10]。这些异常表达的miRNA有的发挥癌基因的作用，有的发挥抑癌基因的作用，还有的则会影响甲状腺癌的转移等。

3.1 miRNA及其调控靶基因在甲状腺癌发生发展中的作用

Vriens等[11]对104例甲状腺组织的miRNA表达谱分析发现，miR-100、miR-125b、miR-138、miR-768-3p 在PTC、FTC、ATC等恶性肿瘤呈高表达，在良恶性肿瘤中的表达差异有统计学意义，提示这四种miRNA可能与甲状腺恶性肿瘤的发生有关。Keutgen等[12]应用RT-PCR技术检测术后29例难诊断甲状腺结节的细针穿刺（FNA）组织中六种 miRNA（miR-222、miR-181a、miR-146b、miR-328、miR-197、miR-21）的表达情况发现 ，miR-222、miR-21、miR-181a、miR-146b在良恶性结节中的表达差异显著，提示这四种miRNA可能与甲状腺癌的发生有关，并可作为难诊断的FNA组织的辅助鉴别方法。Pallante等[13]在分析PTC的miRNA表达谱时发现有6种miRNA相对正常甲状腺组织有较高的水平， 分别为 miR-221、miR-222、miR-213、miR-220、miR-181b、miR-146，其中在所有肿瘤样品中均增高的有miR-221、miR-222和miR-181b。Kit是细胞分化和生长中重要的酪氨酸激酶受体，研究发现，PTC组织或细胞系中miR-221、miR-222和 miR-146过度表达，而 Kit蛋白表达显著下降或无法检出，可能的原因是与前三者结合的Kit的3′-UTR端结合区域关键部位出现单核苷酸多态性，从而导致Kit转录下降，蛋白水平低下，是其靶基因，证实了miR-221、miR-222、miR-181b表达上调是人类 PTC的特征性表现，同时可通过分析甲状腺组织中这些miRNA的表达水平来鉴别其良恶性。Visone等[14]研究发现miR-221和miR-222在PTC中呈高表达，而p27kip1蛋白水平下调，miR-222和 miR-221可能通过与 p27kip1mRNA3′-UTR中的 1262-1269、1336-1342和 1660-1667三个位点结合，对p27kip1基因的负调控来诱导PTC的发生，同时发现无论是转染miR-221和miR-222还是它们各自的抑制物，都没有发现p27kip1mRNA水平的明显改变，结果表明miR-221和miR-222可能是通过抑制p27kip1mRNA的翻译而不是通过降解p27kip1mRNA来调控p27kip1蛋白的表达。Yip等[15]在比较17例有复发或转移的PTC和15例无扩散的PTC中miRNA的表达情况中发现，复发或转移组中miR-146b、miR-222 高表达和 miR-1、miR-34b、miR-130b 低表达，两组比较差异有显著性，同时发现miR-1、miR-34b低表达导致MET基因蛋白高表达，并与肿瘤的侵袭性相关，MET可能为 miR-1、miR-34b的靶基因。Dorris等[16]在111例甲状腺标本中研究发现，桥本甲状腺炎与PTC相比，miR-141表达明显下调，miR-141可能成为区分桥本甲状腺炎与PTC的一个重要标志物。Yu等[17]分析106例 PTC、95例甲状腺良性结节和44例健康志愿者血浆中的miRNA表达谱发现，miR-let-7e、miR-151-5p、miR-222 在 PTC 患者血浆中的表达明显高于良性结节及健康志愿者，这三种miRNA的诊断敏感性及特异性较高，且miRNA的高表达还与癌组织的大小、淋巴结转移、组织浸润等肿瘤TNM分期直接相关，术后miR-151-5p、miR-222表达明显下降。

Weber等[18]比较FTC和腺瘤中miRNA的表达水平发现 miR-192、miR-197、miR-328和 miR-346在癌组织中水平升高。将miR-197和miR-346的反义寡核苷酸转染到细胞株FTC133和K5，与无转染的对照相比，细胞生长抑制有显著差异，同时发现miR-197和miR-346高表达的FTC组织中靶基因 ACVR1、TSPAN3和 EFEMP2表达降低，其中EFEMP2作为miR-346的靶基因，是一种抑癌因子，主要起稳定细胞外基质作用，而ACVR1和TSPAN3为miR-197的两个靶基因，其中ACVR1作为激活素A配体和转化生长因子β1的受体，具有抑制细胞生长的作用，三者的异常表达共同促进甲状腺癌的增殖和侵袭能力，认为miR-197和miR-346与FTC的发生有关，并在其中充当癌基因。Nikiforova等[19]在FTC的研究中发现上调最多的miRNA 有 miR-187、miR-224、miR-155、miR-222 与 miR-221，在增生性结节中却没有发现miRNA上调。此外，Colamaio等[20]发现miR-191在FTC中的表达明显下调，可能通过靶向调节CDK6，抑制细胞周期使细胞阻滞在G1期而抑制了细胞增殖。

Visone 等[14]在研究人 ATC 中发现，miR-30d、miR-125b、miR-26a和miR-30a-5p显著性减少，并进一步通过Northern Blot、RT-PCR分析发现 miR-125b和 miR-26a的下调作用在诱导癌变起了关键作用，相反，miR-30d和miR-30a-5p则是上调机制而诱发癌变，且通过上调ATC细胞中miR-125b和miR-26a的表达，成功地促进HMGAI和HMGA2基因表达，从而减少细胞的增生，认为HMGAI和HMGA2可能为miR-125b和 miR-26a的靶基因。Braun等[21]发现在ATC中miRNA-200和miRNA-30表达显著降低，并且这些miRNA表达失常导致肿瘤细胞上皮-间充质转化，从而增强ATC的侵袭能力，从而为今后ATC的治疗提供有效的分子基础。Takakura等[22]利用miRNA芯片分析和Northern Blot技术证实了miR-l7-92簇在人ATCARO和FRO细胞系过度表达，为了研究这些miRNA在ATC中的功能，他们将其抑制因子miRNA转染到ARO和FRO细胞系中，发现miR-17-3p导致细胞生长完全受抑制，并推测是半胱天冬酶激活引起凋亡，而抑制 miR-17-5p和miR-19a的表达可以使视网膜母细胞基因 1（RB1）和 PTEN蛋白表达增加，从而抑制细胞增生和促进细胞调亡，后二者可能为其靶基因。研究认为，miR-17-92簇对人ATC具有重要的调节作用，同时这些研究为ATC的基因治疗提供了新的思路。

有关miRNA与甲状腺髓样癌（MTC）的研究较少，目前普遍认为MTC是由RET原癌基因突变引起。Abraham等[23]在比较家族性髓样癌（HMTC）及散发性髓样癌（SMTC）miRNA表达的差异发现，SMTC中miR-183和miR-375高表达，而miR-9低表达，并且 miR-183、miR-375与髓样癌远处转移、术后肿瘤复发、淋巴结转移等相关。Mian等[24]将MTC与正常甲状腺组织进行miRNA芯片比较，发现miR-9、miR-21、miR-127、miR-154、miR-183、miR-224、miR-323、miR-370、miR-375在MTC组织中明显上调，其中 miR-127与RET基因突变明显相关。

3.2 miRNA与甲状腺癌相关体细胞基因改变

甲状腺癌发生包含了一系列高发的遗传事件，如PTC的发生与染色体重组致癌基因融合（RET/PTC1、RET/PTC3），RAS、BRAF基因突变等有关[25]，而FTC主要与PAX8/PPAR融合基因、RAS基因突变有关[26]。 RET、BRAF、RAS基因改变均与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导通路中激酶的激活有关，而MAPK信号传导通路的激活与肿瘤的形成、生长及转移密切相关。近年来，研究发现甲状腺癌相关体细胞基因改变与miRNA的异常表达有关。Huang等[27]在研究69例PTC及其周围正常甲状腺组织中发现，BRAF（V600E）的突变率为47.8%，并发现12种miRNA表达上调，6种表达下调，其中BRAF基因突变导致miR-21和miR-203的表达失调，BRAF突变和miR-21过表达与PTC高侵袭性和转移密切相关。Yip等[15]在PTC的研究中发现miRNA的表达与突变或重排位点（BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8-PPARγ）有显著关联，且与肿瘤的复发或转移密切相关。Sheu等[28]应用 RT-PCR方法研究 10例 PTC，18例甲状腺透明变梁状肿瘤（HTT）及周围正常甲状腺组织，10例甲状腺滤泡性腺瘤及10例非毒性结节性甲状腺肿（MNG）组织中5种miRNA（miR-146b、miR-181b、miR-21、miR-221、miR-222）表达的差异性中发现PTC中存在BRAF（V600E）基因突变、RET/PTC1和RET/PTC3基因重排，同时 5种 miRNA均表达上调，而在后四种组织中5种miRNA均低表达，且均无BRAF基因突变、RET/PTC1和 RET/PTC3基因重排；研究认为HTT因为缺少PTC中miRNA的表达模式和基因突变、基因重排的特征，从而不支持HHT可能是PTC透明变梁状亚型的观点。Nikiforova等[29]发现miR-221、miR-222、miR-146b在PTC样本中无同时增高的趋势，但在BRAF突变的多数样本中表现为同时增高，而miR-187在RET/PTC和RAS突变的样本中表达明显增高。Ricarte等[30]研究发现，RET/PTC突变的细胞系中，增强的RET癌基因可降低miR-let-7f的表达，从而导致PTC的发生发展。Rippe等[31]发现在FTC中C19MC和miR-371-3基因簇接近于染色体19q13.4，而该区带在甲状腺腺瘤中常发生重排，在发生重排的细胞株中C19MC和miR-371-3基因簇表达显著增高。Chou等[32]发现miR-146b在发现BRAF基因突变的PTC患者中显著高于未发现突变者，且与PTC的侵袭性有关，而Chen等[33]发现miR-146b在 PTC中过度表达，但与BRAF突变位点相独立。因此miRNA的失调可能与甲状腺肿瘤相关基因存在相关关系，但尚需要全面深入的研究。

4 miRNA在甲状腺癌中的应用前景

由于miRNA在体内形成RNA沉默复合体，产生转录后基因沉默效应，调控基因的表达，调节生物发育、细胞分化与凋亡，并作为抑癌基因或致癌基因，以抑癌基因表达下调或癌基因表达上调促进肿瘤的发生，从这种意义上理解，可以通过寻找具有致癌基因和抑癌基因性质的miRNA作为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。miRNA在多种肿瘤组织中拥有自己独特的miRNA表达特征、生物标记，人们可以利用这些标记来对肿瘤进行分型以及对预后指标作出判断。

多种 miRNA在 PTC、FTC、ATC及 MTC中过度表达或低表达，在甲状腺癌的发生发展过程中起重要作用，运用Northern Blot、miRNA芯片和 RT-PCR等方法研究 miRNA在甲状腺癌中的表达谱，将有助于甲状腺癌的早期诊断、高危人群的普查、预测转移和复发、肿瘤的预后评估及靶向治疗。

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