添加生香酵母改善酱油风味的研究

添加生香酵母改善酱油风味的研究

传统的酱油酿制以大豆、小麦为原料，经过天然晒制而成。产品的酱香及酯香突出，但发酵周期长，设备利用率低，还受季节环境的影响限制，目前占国内酱油的比例很小[1-2]。我国酱油主要采用低盐固态发酵工艺，也有部分酱油采用低盐稀态发酵工艺[3]。这两种工艺虽然具有发酵周期短（15～25d）、原料蛋白利用率高和生产成本低等优点，但其发酵温度高，不利于酵母菌的生长、繁殖，以致生产的酱油风味香气不足[1]。

酱油的风味与多种微生物有关，其中酱油酵母对其风味的形成有重要影响[1]。从传统酱油醪分离出来与酱油质量密切有关的酵母主要是鲁氏酵母和球拟酵母，其在酱油酿造过程中赋予了酱油醇香、酯香等风味物质[1，4-5]。为了提高酱油的风味，有的酱油厂在发酵后期添加酱油酵母，取得了良好的效果[6-9]。本研究在陈强[9]探索的低盐稀态发酵酱油生香发酵工艺的基础上，在低盐稀态发酵酱油中添加2株耐盐酱油酵母进行发酵，通过比较分析酱油生香发酵前后主要理化指标和挥发性风味成分的变化差异，为应用酱油酵母生香发酵技术，以改善低盐稀态发酵酱油的风味提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生酱油——低盐稀态发酵酱油，酵母JM01和JM06：李锦记（食品）有限公司；

氢氧化钠、甲醛、盐酸、葡萄糖、重铬酸钾、乙醇（分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

UV1100紫外可见光分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；PAL-α Brix计：日本ATAGO公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；794全自动滴定仪：瑞士万通（中国）有限公司；TRACE GC-MS-2000气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Finnigan公司；HP-INNOWAX毛细管柱：上海笛柏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低盐稀态发酵酱油酵母生香发酵工艺流程

低盐稀态发酵酱油酵母生香发酵工艺参考陈强[9]的研究，并进行优化，工艺见图1。

图1 低盐稀态发酵酱油酵母生香发酵工艺流程Fig.1 Process of improving soy sauce flavor by the addition of aroma-producing yeast

1.3.2 生酱油调配标准

调配低盐稀态发酵酱油的NaCl含量为12%～14%，氨基酸态氮含量为0.8～0.9g/100mL，总酸含量为2g/100mL左右，可溶性固形物含量为28%～30%，pH值为4.5～5.0，还原糖含量为1.8～2.0g/100mL。

1.3.3 添加酵母静置生香发酵

调配好的低盐稀态酱油接种酱油酵母，JM06接种量为4%（v/v），JM06与JM01的接种比例为1∶1，发酵温度30℃，发酵时间7d。

1.3.4 常规指标测定

氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AN）、总酸均按国标GB 18186—2000《酿造酱油》中规定测定；还原糖按国标GB/T5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中方法测定；固形物采用Brix比重计测定；总酯含量测定：连续电位滴定法；酒精含量测定：重铬酸钾比色法。

1.3.5 酱油挥发性成分测定

固相微萃取：取样品30mL密封于100mL顶空样品瓶，置于40℃水浴中电磁搅拌，固相微萃取纤维顶空萃取40min，250℃解吸3min后进样。

气相色谱分析条件：HP-INNOWAX毛细管柱（30mm× 0.25mm）；载气He，流速1.0mL/min；程序升温，起始温度45℃保持5min，升温速率5℃/min，温度至200℃，保持15min，升温速度10℃/min，最终温度220℃，保持5min；汽化室温度220℃，进样量0.8μL。

质谱分析条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70eV，发射电流200μA，电子倍增器电压350V，离子源温度200℃，质量扫描范围35～335amu。

数据处理：试验数据处理由Xcalibur软件完成，在美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）谱库（107 000个化合物的数据）和Wiley谱库（320 000个化合物的数据，Version 6.0）对未知化合物进行检索并计算匹配度，只有当正反匹配度均大于800（最大值为1 000）时才能确证该物质。

2 结果与分析

2.1 低盐稀态酱油生香发酵前后主要理化指标比较

根据陈强[9]的研究，采用酵母生香发酵最优工艺对低盐稀态发酵生酱油进行生香发酵，发酵结束后取样测定其总酸含量、氨基酸态氮含量、总酯含量、酒精含量、可溶性固形物含量和还原糖含量，与生香发酵前的原低盐稀态发酵酱油进行对比，结果见表1。

表1 酵母生香发酵前后低盐稀态酱油的理化指标对比Table 1 Comparison of physiochemical properties of soy sauce before and after aroma-producing yeast fermentation

由表1可知，低盐稀态发酵酱油生香发酵后总酸、总酯、酒精含量明显提高，可溶性固形物、还原糖含量基本保持不变，氨基酸态氮含量有略微降低。

感官评价方面，生香发酵后的酱油酯香、醇香浓郁，香气柔和，风味得到了极大的改善。结果表明，酱油酵母在低盐稀态酱油得到良好的繁殖代谢，产生的醇类、酯类和有机酸类等物质增加了酱油风味，并在一定程度上降低了原酱油的不良气味。增香后风味评价结果与李琴等[10]的研究结果一致，即酵母菌的添加明显改善酱油风味。

2.2 低盐稀态酱油生香发酵前后挥发性风味成分比较

采用固相微萃取技术对酱油挥发性成分进行提取，并利用气-质联用法进行测定，低盐稀态发酵酱油生香发酵前后的主要挥发性风味成分的质谱图见图2和图3。

图2 低盐稀态发酵酱油生香发酵前的挥发性风味成分总离子流图Fig.2 Total ion chromatograms of GC-MS analysis before low-salt diluted-state soy sauce fermentation by aroma-producing yeast

由图2和图3可知，生香发酵后的酱油与原低盐稀态发酵酱油相比，其挥发性成分出现了显著的差异，物质的种类和含量差异（峰面积归一法）见表2。

图3 低盐稀态发酵酱油生香发酵后的挥发性风味成分总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of GC-MS analysis after low-salt diluted-state soy sauce fermentation by aroma-producing yeasts

表2 酵母生香发酵前后酱油中的主要挥发性成分比较Table 2 Comparison of the main volatile flavor components of soy sauce before and after fermentation

由表2可知，原低盐稀态发酵酱油生香发酵后的醇类、酯类、醛类、酸类、酚类和其他化合物等6类主要挥发性成分在种类和含量上都产生明显的变化，特别是醇类、酯类这两类物质在挥发性成分中的比例明显提高。

2.2.1 醇类化合物

原低盐稀态发酵酱油检测出7种主要醇类物质，酱油生香发酵后检测到8种，新增的醇类物质为苯甲醇和4-异丙烯基-5-甲基-4-乙烯基-1-醇，减少的醇类物质为异辛醇。

原酱油添加生香酵母发酵后，酱油中的醇类物质在挥发性成分中的比例由43.76%提高至64.95%，总含量明显提高。其中，苯乙醇由生香发酵前的1.68%增加至11.75%；3-甲硫基-1-丙醇由生香发酵前的0.55%增加至0.75%。其均是传统酿造酱油的特征香气成分，苯乙醇是酵母菌的代谢产物，来源于酒精发酵过程中苯丙氨酸的降解，具有独特的紫罗兰香、丁香、茴香味、蜂蜜味及青甜玫瑰的气息，而3-甲硫基-1-丙醇在浓度较低时即有强烈的肉汤香味[11-12]。

2.2.2 酯类化合物

原低盐稀态发酵酱油中检测出4种酯类物质，酱油生香发酵后检测出6种，新增加的物质为乙酸异戊酯和醋酸苯乙酯。

原酱油生香发酵后，酯类物质在挥发性成分中的比例由0.99%增至12.08%，在种类和百分含量上均有了显著的增加。其中乙酸异戊酯和醋酸苯乙酯的升幅最大，分别由生香发酵前的0%和0.31%上升至6.19%和5.52%。乙酸异戊酯具有较强的新鲜果香、稍甜，有类似熟香蕉、生梨和苹果的香味，醋酸苯乙酯具有桃子香气，这两种物质百分含量的大幅上升对酱油风味的改善起到了重要的作用。酯类物质提高的主要原因是酵母发酵过程中产生的酯化酶对有机酸类与醇类进行酯化作用，这也是挥发性酸类物质含量下降的主要原因[13-15]。

2.2.3 醛类化合物

酱油生香发酵前后均检测出8种醛类物质，其中相同的成分有7种，分别为壬醛、糠醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛、α-亚乙基-苯乙醛和茴香醛，酱油生香发酵后新增了肉桂醛，减少了辛醛。醛类物质在挥发性成分中所占的比例明显降低，由10.08%下降为4%。醛类物质一般不是酱油的特征风味成分，但其能够与酱油酵母代谢产生的醇类或硫化物反应，提高酱油风味[1]。

2.2.4 酸类化合物

原低盐稀态发酵酱油中检测出5种挥发性酸类物质，酱油生香发酵后检测到7种，其中相同的酸类物质有醋酸、丁酸、戊酸和4-甲基戊酸，新增加的酸类物质为反-2-乙烯基环戊烷羧酸、辛酸和癸酸，减少的酸类物质有异丁酸。酸类物质在挥发性成分中所占的比例也明显降低，由14.45%下降为5.4%，特别是醋酸由10.65%下降为3.94%，表明低盐稀态发酵酱油中的酸类物质与酵母代谢产物醇类物质发生了反应。另外，常规理化指标显示酱油生香发酵后总酸由1.77g/100mL增至1.94g/100mL，表明了酵母在发酵过程中产生了非挥发性有机酸类物质，其主要来源酵母的三羧酸循环[1]，而挥发性酸类物质由于酯化而降低。因此，酸类物质的变化促进了酱油风味的柔和。

2.2.5 酚类和其他类化合物

酱油生香发酵前后均检测出4种酚类物质，其中愈创木酚、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚均是天然发酵酱油里特有的香气物质，由于生香发酵时间短，此类风味物质变化不大。

其他类化合物包括吡嗪等含氮化合物、呋喃等含氧杂环化合物、噻唑等含硫化合物以及烃类化合物等，虽然这些物质的种类和百分含量在酱油生香发酵后有所下降，但是这些化合物具有非常低的风味阈值，仍然对酱油的整体风味贡献很大。

综合表明，低盐稀态发酵酱油添加生香酱油酵母发酵后，醇类和酯类这两类物质在挥发性风味成分中的比例显著提高，特别是异戊醇、3-甲硫基-1-丙醇、苯乙醇、乙酸异戊酯和醋酸苯乙酯等含量比例的提高大大改善了酱油的香气；在生香酵母的作用下，醛类、酸类、醇类和其他类化合物形成酱油新的香气成分，既减少一些不良风味，又促进酱油风味更加柔和。

3 结论

低盐稀态发酵酱油生香发酵后总酸、总酯、酒精含量明显提高，分别由1.77g/100mL、7.84g/100mL和0.09%增至1.94g/100mL、9.85g/100mL和2.12%；可溶性固形物、还原糖含量基本保持不变，氨基酸态氮含量略微降低。

通过气相色谱质谱联用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）对低盐稀态发酵酱油生香发酵前后的挥发性风味成分进行分析，醇类和酯类物质在挥发性风味成分中的比例由原来的43.76%和0.99%分别提高至64.95%和12.08%；醛类和酸类物质由10.08%和14.45%分别下降为4%和5.4%。

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李学伟1，陈强2，朱新贵1*
（1.李锦记（新会）食品有限公司，广东江门529156；2.山东益生源微生物技术有限公司，山东潍坊262700）

在低盐稀态酱油中添加2株耐盐酱油酵母进行生香发酵，对酱油生香发酵前后的风味进行比较研究。结果表明，酱油生香发酵后总酸、总酯、酒精含量明显提高，分别由1.77 g/100mL、7.84 g/100mL和0.09%增至1.94 g/100mL、9.85 g/100mL和2.12%。通过GC-MS分析，醇类和酯类这2类物质在挥发性风味成分中的比例分别由原来的43.76%和0.99%提高至64.95%和12.08%，而醛类和挥发性酸类物质分别由10.08%和14.45%下降为4%和5.4%。特别是异戊醇、3-(甲硫基)-1-丙醇、苯乙醇、乙酸异戊酯和醋酸苯乙酯等含量比例的提高明显改善了酱油的香气。感官评定，生香发酵后的酱油酯香和醇香浓郁，香气柔和，风味得到了极大的改善。

低盐稀态酱油；耐盐酱油酵母；风味成分；气相色谱-质谱法

Improving the soy sauce flavor by the addition of aroma-producing yeast

LI Xuewei1,CHEN Qiang2,ZHU Xingui1*
(1.Lee Kum Kee(Xinhui)Foods Co.,Ltd.,Jiangmen 529156,China;2.Shandong Yishengyuan Microbial Technology Co.,Ltd., Weifang 262700,China)

Two strains of salt-tolerant yeast were applied to improve the flavor in the low-salt diluted-state soy sauce,and the flavors of the soy sauce before and after the fermentation were analyzed.The result showed that the contents of total acid,total esters and alcohol content increased greatly, the indexes improved from 1.77 g/100ml,7.84 g/100ml and 0.09%to 1.94 g/100ml,9.85 g/100ml and 2.12%,respectively.According to the analysis by GC-MS,the percentages of alcohol and esters in the volatile flavor components increased from original 43.76%and 0.99%to 64.95%and 12.08%, respectively,while the percentages of aldehydes and volatile acids decreased from original 10.08%and 14.45%to 4%and 5.4%,respectively.Especially,the soy sauce flavor was significantly improved as the proportions of isoamyl alcohol,3-(methylthio)-1-propanol,benzeneethanol,isoamyl acetate and phenylethylacetate increased.Through sensoryevaluation,the soysauce byaddition ofaroma-producingyeastwasmore harmoniousand mellow.

low-salt diluted-state soy sauce;salt-tolerant yeast;flavor;GC-MS

TS264.2

A

0254-5071（2014）03-0121-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.029

2014-01-14

李学伟（1981-），男，工程师，硕士，研究方向为调味品开发及食品工艺。

*通讯作者：朱新贵（1967-），男，副教授，博士，研究方向为食品科学。