鸡西地区猪戊型肝炎病毒的检测及序列分析

曲立春 黑龙江工业学院 158100

本文将探讨鸡西地区猪戊型肝炎病毒检测结果及分析其序列特征，为确定本地区猪戊型肝炎病毒基因型提供可靠依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在鸡西地区60 个猪场采集猪粪便样本，每个猪场采集10 头猪，共600 份猪粪便样本作为本次研究对象，经冷冻后送回实验室。

1.2 方法

（1）试剂：华南农业大学兽医学院禽病教研室提供DH5a 大肠杆菌；TaKaRa 公司提供DL-2000 DNA Marker、RNase inhibitor、dNTPs、random primers p（N）6、pMD18-T vector、M-MLV、Olig（dT）18、Ex Taq 酶；Invitrogen公司提供Trlzol Reagent；TIANGEN公司提供琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒；其他试剂（异丙醇、氯仿等）均为分析纯。

（2）合成引物：在全基因序列的5725～6452nt 片段上涉及引物（扩增片段348bp）并由上海英骏公司合成（5725～6452nt 片段）：㈠外引物；㈡内引物。

（3）猪戊型肝炎病毒检测及序列分析方法：使用PBS 将粪便样本配制获得10%悬浮液，经3 次反复冻融后以40℃状态下经8000r/min 离心10min，取上清液利用Trlzol Reagent 按照相关说明书操作，经9.5uL DEPC 处理后提取RNA 实施反转录。反转录过程应在冰上操作，反应体系共20uL，组成成分包括9.5uL 病毒RNA；1uL 反转录引物R/O；4uL、5 ×M -MLV Buffer；1uL、200U/uLM -MLV；0.5uL、40U/uL RNase inhibitor；4ul 2.5mmol/L each dNTPs，上述成分混合均匀后于40C 水浴1h后在冰上作用2min 直接PCR 或保存于-400C 条件下待用。PCR 反应体系1（20uL）：2uL、10×MMLV Buffer；2uL dNTP；0.25uL、5U/ulL Ex Taq酶；2ulDNA 模板；0.5uL、20pmol/L M1；0.5uL、20pmol/L M2；13ul ddH2O，PPCR反应体系2（50uL）：0.5uL、5U/uL Ex Taq 酶；1uL、20pmol/L M3；1uL、20pmol/L M4；4uL、10×M-MLV Buffer；4uL dNTP；35.5ul ddH2O；4uL PCR 反应体系1 产物。两轮PCR 于相同条件下反应，即940C 条件下预变性5min，之后于940C 变性1min，530C 条件下退火45s，720C 延伸1min，共实施35 个循环，最后一个循环结束后经720C、10min 延伸。将5uL 第二轮PCR 产物实施琼脂糖凝胶电泳（将1%琼脂糖凝胶加入0.5ug/mL 溴化乙锭中），于紫外检测仪下观察HEV-RNA 检测阳性率，并利用DNAStar、MEGA4.1 生物学软件对所得扩增片段进行序列分析确定基因型。

1.3 统计学方法

使用SPSS13.0 软件包对数据进行统计学分析，计量资料采用t 检验（由±s表示），计数资料采用X2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

600 份猪粪便样本中106 份经检测为HEVRNA 阳性（阳性率17.67%），494 份阴性（阴性率82.33%），阳性样本序列与基因IV 型相似度最高，对比结果具有统计学意义（P＜0.05）。122 份阳性样本序列分析结果见表1。

表1 122 份阳性样本序列分析（%）

3 讨论

戊型肝炎病毒（HEV）属于戊型肝炎病毒科（Hepeviridae）、戊型肝炎病毒属（genus Hepevirus），呈球状颗粒状态（二十面体），直径约32nm，是一种单股、无囊膜、正链RNA 病毒，由Meng 等人于1997年首次分离获得[1]。

研究表明，目前临床将HEV 分为五个基因型，即人感染HEV I 型、II 型，人畜共患HEV III 型、IV型，禽感染V 型。本文研究可知，鸡西地区猪戊型肝炎病毒阳性率较高（17.67%），且序列分析可知均属于人畜共患IV 型HEV，与国内其他地区相关报道相符。提示畜牧工作者应提高警惕，将预防及干预猪戊型肝炎病毒感染作为工作重点，采取多种有效措施降低猪感染戊型肝炎病毒几率，阻断人畜共患疾病传播途径，保障人们饮食健康及生活质量。

[1]孙中锋，金宁一，朱光泽，等.长春地区人与猪戊型肝炎病毒分子流行病学及部分基因序列分析[J].中国人兽共患病学报，2013，22(10)：941.