急性温度胁迫对虹鳟肝脏代谢酶活性及生长相关基因表达的影响

管标，温海深，刘群，王金环，王庆龙

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东 青岛266003)

变温动物的生长、代谢、发育等都受到环境温度的影响，在可能的情况下鱼类总是选择在最适宜的环境中生存。许多鱼类会通过降低代谢速率和生长速度来应对较低温度，而温度迅速升高后，鱼类又会很快达到耐受范围，但只能存活很短的时间。温度骤变是鱼类在运输、养殖生产甚至自然条件下都可能面临的胁迫，能抑制鱼类的摄食、生长，从而对鱼类的生理适应和代谢产生重大影响［1］。

鱼类通过内分泌系统来调节新陈代谢和生长，以应对环境的变化和不同的生长阶段［2］。与许多高等脊椎动物一样，鱼类生长发育很大程度上也是通过生长激素(GH)——类胰岛素样生长因子(IGF)轴进行调控的［3］。生长激素能够调控机体的生长、免疫、代谢、渗透调节等多种行为，并通过靶组织与生长激素受体(GHR)结合发挥生理作用［4］。生长激素存在两种受体，即GHR1和GHR2，在多种鱼中均有发现，并且在大多数组织中广泛表达［5］。GH 对生长的促进作用直接或间接地通过IGFs 来实现，包括IGF-1和IGF-2，IGFs具有胰岛素类似物的作用，同时又可促进个体的细胞分化与增殖［6］。其中，IGF -1 通过自分泌和旁分泌作用在多个器官内产生，但主要在肝脏内合成［7］，通过血液运送到各个组织，促进细胞的分裂和分化，促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的降解，促进机体生长［8］。Shepherd等［9］研究发现，海水养殖罗非鱼Oreochromis mossambicus 脑垂体中的GH 升高，血浆中IGF-1 基因表达水平也升高。而IGF-2在鱼类新陈代谢中的作用尚不清楚。在哺乳动物中，IGF -2 基因表达主要是在胚胎发育阶段［10］，而Reinecke等［11］研究发现，IGF-2在幼鱼和成鱼体内均有广泛的表达。IGF-2和IGF-1 有较高的同源性，在鱼类的不同组织中二者的基因表达受到GH 的调控［12］，Chen等［13］试验证明，IGF-1和IGF-2 均可刺激罗非鱼快速生长。

血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)是联系蛋白质代谢和糖代谢的重要氨基转移酶，是检测肝脏功能是否正常的重要指标。正常情况下，AST和ALT 主要存在于肝脏和其他组织的线粒体内，只有少量被释放到血浆中，因此，血清中的ALT 活性较小［14］。碱性磷酸酶(ALP)是一种在生物界中分布广泛的磷酸酯酶，通常分布于溶酶体内，在溶酶体外的胞浆基质内和内质网内也有少量分布。ALP 的主要生理功能是参与磷及磷酸酯的代谢调节，同时还参与调节机体代谢、钙磷比例和机体信号传导等许多生理活动［15］。而关于这些生理学指标对温度胁迫响应机制的研究目前鲜有报道。

虹鳟Oncorhynchus mykiss 隶属于鲑形目Salmoniformes、鲑科Salmonidae、大马哈鱼属Oncorhynchus，为冷水性优良养殖品种。但虹鳟生活温度适宜区间小，其适宜生长水温为12 ～18 ℃［16］，这对虹鳟的养殖和运输等都会产生不利影响。本研究中，进行了高温和低温胁迫对虹鳟血清中转氨酶ALT、AST和ALP 活性的影响以及对血清IGF -1激素含量变化的试验研究，同时分析了急性温度胁迫对虹鳟GHR1、IGF -1和IGF -2 mRNA表达的影响。通过该项研究，探究急性温度胁迫对虹鳟生理适应及代谢机制的影响，尤其是对其肝脏功能的危害程度，旨在丰富鱼类生理学内容，为鱼类运输与养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用虹鳟共135 尾，于2012年3月采自山东潍坊某养殖场，试验鱼健康活泼，为同一批次卵孵化。试验开始时虹鳟体质量为(240 ±18)g，体长为(25.7 ±1.7)cm。

试验用仪器和试剂主要有:BS -180 生化分析仪，由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产;ALT、AST、ALP 试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;IGF -1 试剂盒购自天津九鼎医学生物有限公司;RNAiso Reagent 试剂、Taq 酶、DNaseⅠ(RNasefree)、RNasin、RNA 酶和SYBR Premix Ex Taq 均购自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 试验条件与饲养管理 试验于2012年4月在中国海洋大学鱼类生理与繁育实验室全循环水系统中进行，试验鱼在循环水系统中暂养驯化2 周，暂养及试验期间全循环流水，连续充气，温度为(16 ±1)℃，pH 为7.8 ～8.1，溶解氧(DO)＞6 mg/L。试验期间，虹鳟的投喂量和投喂方式与驯化期间相同，每天8:00和16:00 饱食投喂鲟鱼配合饲料。

1.2.2 试验设计与样品采集 试验设计1 个对照组和2 个处理组，分别为A 组(常温对照组，水温为16 ℃)、B 组(低温处理组，水温为6 ℃)、C 组(高温处理组，水温为24 ℃)，每组温度变化在1 ℃以内。每个处理组设3 个平行，每个平行放5 尾鱼，共45 尾鱼。将驯化后的虹鳟放入2 个处理组中热应激2 h，再放入正常养殖的循环水系统中恢复。分别在恢复0、6、12、24、48 h 时采样，每个试验组每次采样3 尾。

采样前将试验鱼放入MS -222 麻醉剂(40 ～45 g/L)中麻醉，以减少采样操作等对试验的影响。从鱼尾静脉采血，将采集的血液放于冰箱(4℃)中静置4 ～6 h 后，以12 000 r/min 离心15 min，提取血清并置于超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。采集完血样后迅速解剖试验鱼，取新鲜的肝脏组织于液氮中速冻，然后转移至超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。

1.2.3 ALT、AST和ALP 活性的测定 采用BS -180 生化分析仪测定血清中ALT、AST和ALP 活性。

1.2.4 IGF-1 激素含量的测定 采用放射性同位素(125I)标记的放射免疫法(RIA)测定血清中IGF-1 激素含量。根据IGF-1 试剂盒说明书并结合本实验室条件进行改进，采用半量法进行测定，每个样品设置2 个平行。

1.2.5 实时定量PCR 标准曲线的建立以及目的基因的定量测定 根据Flores等［17］的方法设计GHR-1 实时定量表达引物。根据NCBI 已经克隆得到的IGF -1(M95183.1)和IGF -2(M95184.1)cDNA 的序列，利用Primer 5.0 软件设计实时定量表达。表达所需的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体引物如表1所示。

对样品cDNA 进行4 倍梯度稀释，以稀释后的cDNA 为模板进行实时定量PCR，每个模板设3 个平行。PCR 反应体系(共20 μL):SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应条件:95 ℃下预变性1 min;95 ℃下变性10 s，相应基因退火温度下退火40 s，72 ℃下延伸40 s，共进行40 个循环。实时连续测定扩增过程中产生的荧光，建立标准曲线。

表1 虹鳟GHR-1、IGF-1、IGF-2和18 S 基因表达所用引物Tab.1 Primers used in expression of GHR -1，IGF -1，IGF-2 and 18 S genes in rainbow trout Oncorhynchus mykiss

对样品中的cDNA 进行目的基因扩增，反应体系以及反应条件与标准曲线的建立一致，每个样品设3 个重复。根据实时荧光定量PCR 的结果，以18 S 为内参基因，根据目的基因以及18 S 的Ct值，按照2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达情况。

1.3 数据处理

试验数据均用平均值± 标准误表达。采用SPSS 13.0 软件进行单因素方差分析和邓肯多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 急性温度胁迫对虹鳟血清中AST、ALT和ALP 活性的影响

温度胁迫2 h 后，虹鳟血清中AST 活性在低温和高温两个处理组中的变化趋势相同，在胁迫后恢复0 h 时均略有升高，恢复6 h 时达到最大值，且与对照组有显著性差异(P＜0.05);恢复12 h 后，AST 活性逐渐降低并恢复至接近对照组水平(图1 -A)。

高温处理组的ALT 活性变化趋势与AST 相同;而低温处理组在胁迫后恢复0 h 时就显著升高(P＜0.05)，随后逐渐降低至对照组水平(图1 -B)。

低温处理组的ALP 活性，在温度胁迫后恢复6 h 时后均显著低于对照组(P＜0.05);而高温组的ALP 活性在温度胁迫后虽有所降低，但与对照组无显著性差异(P ＞0.05)(图1 -C)。

图1 温度胁迫后虹鳟血清中AST、ALT和ALP 活性的变化Fig.1 Changes in serum activities of AST，ALT and ALP in rainbow trout exposed to acute temperature stress

2.2 急性温度胁迫对虹鳟血清中IGF -1 激素含量的影响

温度胁迫对虹鳟血清IGF -1 含量有显著的影响。从图2可见:温度胁迫后恢复0 h 时，两个处理组血清IGF-1 含量均急剧降低，且与对照组有显著性差异(P＜0.05);低温处理组血清IGF -1含量在整个试验过程中均处于较低水平，恢复6、12、48 h 时与对照组有显著性差异(P＜0.05);而高温处理组血清IGF -1 含量在12 h 后逐渐恢复，在48 h 时达到对照组水平。

2.3 急性温度胁迫对虹鳟肝脏GHR1、IGF-1和IGF-2 mRNA表达的影响

急性温度胁迫对3种基因表达有不同程度的影响。对于GHR1 基因，低温和高温处理组mRNA表达量均有减少，但与对照组无显著性差异(P ＞0.05)，整个试验过程中GHR1 mRNA表达量处于较稳定水平(图3 -A)。

图2 温度胁迫后虹鳟血清中IGF-1 含量的变化Fig.2 Changes in serum IGF-1 level in rainbow trout exposed to acute temperature stress

图3 温度胁迫后虹鳟肝脏中GHR1、IGF-1和IGF-2 mRNA表达量的变化Fig.3 Changes in GHR1，IGF -1，and IGF -2 mRNA expression in liver of rainbow trout exposed to acute temperature stress

对于IGF-1 基因，低温处理组mRNA表达量在整个试验过程中有所降低，但与对照组无显著性差异(P ＞0.05);而高温处理组IGF -1 mRNA表达量在恢复6、12 h 时显著低于对照组(P＜0.05)，12 h 后逐渐恢复至对照组水平(图3-B)。

对于IGF -2 基因，温度胁迫后恢复0 h 时，两个处理组mRNA表达量都急剧下降，高温组与对照组有显著性差异(P＜0.05)，且在整个试验过程中均显著低于对照组(P＜0.05)，其中高温处理组的下降程度大于低温处理组(图3 -C)。

3 讨论

ALT和AST是两种重要的转氨酶。正常情况下两种酶多存在于细胞的线粒体中，其中尤以肝脏中含量丰富，而血清中活性很低。当机体受到损害时，细胞膜的通透性会发生改变，故胞浆酶释放较多，导致血液中ALT和AST 活力明显升高。Vaglio等［18］给金头鲷Sparus aurata 注射剂量为2.5 mg/kg(体质量)的CdCl2，6 d 后血液中的AST和ALT活性显著升高;Dela Torre等［19］将鲤Cyprinus carpio幼鱼暴露在半致死剂量(1.5 ～1.7 mg/L)的Cd溶液中14 d 后，鲤肝脏中的AST和ALT 活性显著升高，表明Cd 暴露对鲤肝脏已造成损伤。本试验中，虹鳟血清中的ALT和AST 活性都在恢复6 h时有显著升高，表明急性温度胁迫对虹鳟的肝脏产生了破坏作用;24 h 后，随着机体的恢复，两种酶活性逐渐降低。ALP在生物体内能够直接参与调节磷代谢，保持体内钙磷比例相对稳定，同时还能够参与蛋白的分泌和脂质代谢等，是一种重要的代谢调控酶［20］。鱼类处于应激状态时，如饥饿、温度胁迫等，将影响血清中ALP 的活性［21］。本试验中，温度胁迫后低温和高温两个处理组虹鳟血清中的ALP 活性均有降低，表明虹鳟体内代谢受到温度胁迫的影响，且随着常温恢复过程，ALP 活性有升高趋势。

鱼类的生长受到“下丘脑- 垂体- 肝脏轴”的调控，GH是促进机体生长的主要激素。但单独的GH 不能促进鱼类的生长，IGF-1是GH 发挥促生长作用的重要中介因子。Bolton等［22］研究发现，直接给虹鳟注射一定剂量的GH 对其生长无促进作用;而McComick等［23］研究发现，给大西洋鲑Salmo salar 注射猪的IGF -1 后，其生长率能快速提高。许多作者都有报道，有害刺激对于鱼类的生长有较强烈的消极影响。捕捞和禁闭暂养刺激会影响到虹鳟血液中GH、IGF -1和IGF -2 的含量，导致其血液中激素含量降低，从而抑制鱼类正常生长［24］。温度胁迫也会影响罗非鱼的摄食与代谢，Bradley等［25］研究发现，罗非鱼的GH 存在耐受机制，IGF-1 迅速降低，而GH 变化较慢。本试验中，急性温度胁迫后，两个处理组的血清IGF-1含量均显著降低，且在整个试验过程中均低于对照组，虹鳟生长相关基因的mRNA表达量也受到温度的影响，且通常与激素含量的变化相对应。

GH是促进生长的主要基因，而GH 发挥作用需要GHR 介导。Ayson等［26］研究发现，饥饿和恢复投喂能使点斑蓝子鱼Siganus guttatus GH mRNA表达量略有降低;Matejka［27］研究发现，小鼠肾脏和肝脏受损后，GHR mRNA 水平显著减少。本试验中，温度胁迫后两个处理组GHR1 mRNA表达量均略有降低，这与Bradley等［25］对尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus 禁食和投喂试验结果相类似。这也从另一方面表明，血清GH 含量可能减少。对许多鱼的研究发现，IGF -1 mRNA在很多组织中都有表达，其中肝脏中表达最丰富［28］，这表明肝脏对于IGF-1 的合成和分泌起着重要作用。IGF -1的表达量受到很多环境因素的影响，Duan［29］研究表明，海鲷Pagrosomus major 较少的摄食量将导致IGF-1 mRNA 水平下降;Larsen等［30］研究发现，低温处理下银大麻哈鱼Oncorhynchus kisutch 的IGF-1 mRNA 水平明显降低。本研究中，急性温度胁迫后，虹鳟肝脏中IGF -1 mRNA 的表达量有所降低，其中高温胁迫后恢复6 h 时显著低于对照组，直到24 h 时才恢复到接近对照组水平。虹鳟属冷水性鱼类，低温胁迫时，虹鳟通过降低代谢速率、减少摄食等维持机体功能，生长速度减少较慢;而高温胁迫能快速达到虹鳟的耐受限度，生长速度急速下降。许多硬骨鱼的IGF -2 不仅在肝脏中表达丰富，而且在许多其他器官如脑、心脏、肾脏、肌肉等中都有很高的表达量［27］。快速生长的斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus 肝脏和肌肉中的IGF-2 mRNA表达量，比慢速生长的斑点叉尾鮰更高，这表明IGF -2在鱼类生长中起重要作用［31］。本试验中，与GH和IGF -1 相比，肝脏中IGF -2 mRNA 水平下降更明显，这说明肝脏中IGF - 2 mRNA 水平更易受到水温等环境变化的影响。

总之，急性温度胁迫对虹鳟血清中ALT、AST和ALP 活性有不同程度的影响，这说明急性温度胁迫对虹鳟的代谢产生了影响。血清IGF -1 激素含量的变化以及GHR1、IGF -1和IGF -2 mRNA表达量的变化，都说明急性温度胁迫对虹鳟生长产生了不良的影响。高、低温处理组虹鳟的不同变化，表明了冷水鱼类对高温胁迫更敏感，本试验也可为虹鳟的运输及养殖条件优化提供参考。

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