海星中抑制ACE 活性的甾体化合物的分离纯化

田丽冉，朱春芃，曲敏，佟长青，金桥，谭成玉，李伟

(1.大连海洋大学 食品科学与工程学院，辽宁 大连116023;2.大连海洋大学 海洋科技与环境学院，辽宁 大连116023)

甾体化合物具有软化血管、活血、强心、抗炎、镇静、促进生长发育等生理活性，并在生殖活动过程中起着重要的作用［1-3］。海星中甾体化合物含量丰富，基本上每种海星都含有甾体类化合物［4］。从海星中得到的甾体化合物，大部分具有3β、6α(或6β)、8β、15α(或15β)、16β - 多羟基胆甾烷母核的结构，有时在4β、5α、7α(或7β)，偶尔在14α 位置具有一个或多个羟基，且一般支链具有25(S)羟基［5-6］。海洋甾体化合物因支链丰富多样、骨架结构新奇、生理活性独特而备受关注［7］。但目前尚未见对海星中具有抑制血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)活性的化学成分的研究，本研究中，以抑制ACE 活性为筛选模型，对海星总甾体化合物进行提取、分离纯化，旨在为海星甾体类物质降血压药物的开发提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用多棘海星Asterias amurensis 采自大连市黑石礁海域。

试验试剂主要有:硅胶(200 ～300 目)、薄层层析板(自制)、血管紧张素Ⅰ转化酶(Sigma 公司)、马尿酸(Sigma 公司)、Hip-His-Leu(Sigma 公司)、齐墩果酸标准品(天津飞鹰制药有限公司)，香草醛、浓硫酸、甲醇(色谱醇，Sigma公司)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、Na2B4O7、H3BO7、CF3COOH等均为分析纯。

试验仪器主要有:高效液相色谱仪(南京科捷分析仪器有限公司)，色谱柱(SinoChrom ODS-BP E1722557，大连依利特公司)，UV1750 紫外分光光度计(岛津仪器有限公司)，冷冻干燥机(北京博医康试验仪器有限公司)，RE -52CS 型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，SY2 -4 型电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)，PHS -25C型数显酸度计(上海创发电子科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 海星总甾体化合物的提取 取20 kg 海星剪碎，于体积分数为70%的乙醇中热浸提2次，每次2 h，过滤，取上清液，用旋转蒸发器减压浓缩得到水溶液，即海星乙醇粗提物，于冰箱(-20℃)中保存备用。

依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的水溶液进行多次萃取，直至有机层基本无色，浓缩，分别得到石油醚萃取部分(65 g)、乙酸乙酯萃取部分(130 g)和正丁醇萃取部分(150 g)。

1.2.2 海星总甾体化合物的分离 将正丁醇部分(150 g)进行硅胶柱色谱，以乙酸乙酯与甲醇的混合液(体积比分别为100∶ 0 ～9、10 ～1∶ 1)进行梯度洗脱，每个比例洗脱5 ～8 个柱体积，分别收集洗脱液，浓缩，通过薄层色谱分析合并流分，得到F1～F88 个亚组分。

1.2.3 海星总甾体化合物的鉴定 利用醋酸酐-浓硫酸反应(Liebermann -Burchard，L -B 反应)检测所得到的物质是否为甾体化合物。将样品溶于冰醋酸中，加入醋酸酐与浓硫酸混合液(体积比为20∶ 1)，观察颜色的变化。

1.2.4 海星总甾体化合物含量的测定 甾体化合物可与香草醛-硫酸溶液发生反应，呈灰绿色，于540 nm 处有最大吸收峰，故常用此方法测定甾体化合物的含量［8］。

分别取浓度为400 μg/mL 的齐墩果酸标准品溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，注入具塞试管中，各加入体积分数为95%的乙醇0.45、0.40、0.30、0.20、0.10、0 mL，补足至0.50 mL，再分别加入0.50 mL 8%的香草醛试剂，摇匀，置于水浴中缓慢加入5 mL 72%的硫酸，摇匀，立即放入62 ℃恒温水浴中保温20 min，迅速取出置于水浴中冷却10 min，在540 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。

分别取适量的海星乙醇粗提物以及石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层中的总甾体化合物，配成一定浓度的溶液，用香草醛-硫酸反应进行测定，操作方法同标准曲线的绘制。各溶剂中总甾体化合物的含量根据标准曲线求出。

1.2.5 ACE活性的测定参考朱晓杰等［9］、Nakamura等［10］的方法进行。用ACE 水解底物马尿酰- 组氨酰- 亮氨酸(Hip - His - Leu，简称HHL)C 末端的二肽His-Leu，生成马尿酸。使用高效液相色谱(HPLC)测定马尿酸生成量，计算ACE 抑制率，从而推测是否具有降血压活性。

将海星乙醇粗提物、石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层样品(以溶剂为溶质)分别配成浓度为100、50、25、12.5 mg/mL 的水溶液，以蒸馏水作为对照。用硼酸缓冲溶液将ACE 配成60 U/L 的酶溶液。取海星甾体化合物样品10 μL 放入0.5 mL的离心管中，加入ACE 30 μL，37 ℃条件下反应5 min 后，加入50 μL 底物溶液，37 ℃条件下继续反应30 min 后，加入10 μL 10%的三氟乙酸终止反应，得到反应液［11］。用HPLC 测定反应液中马尿酸的生成量，A 液:用1000 mL 体积分数为30%的甲醇(含有1 mL 三氟乙酸及0.5 mL 冰乙酸)，B液:用1000 mL 体积分数为70%的甲醇(含有1 mL 三氟乙酸及0.5 mL 冰乙酸)，调A、B 液的pH为3.0 ～3.3，然后进行梯度洗脱，最后在波长为228 nm 下进行测定［11］。

2 结果

2.1 海星总甾体化合物的提取、分离

本试验中用70%的乙醇对海星进行热浸提后，减压浓缩，用等体积的石油醚萃取脱脂，再依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得含大量甾体化合物的部分，剩余的水层部分主要为蛋白质、糖等大分子物质。利用展开剂［φ(氯仿)∶ φ(甲醇)∶ φ(水)=7∶ 3∶ 1］进行薄层层析，结果表明，不同溶剂提取物中均含甾体化合物，但乙酸乙酯和正丁醇溶剂中呈现的斑点较多(图1)。

图1 海星甾体化合物粗品薄层层析图Fig.1 The thin－layer chromatogram(TLC)of steroids in crude extracts from starfish

近年来，已有学者进行了对海星中甾体化合物的分离研究，Ikegami等［12］从多棘海盘车中分离得到新甾体化合物6a - 羟基-3β - 磺酸- 氧化-5a-孕烷-9(11)-双键-20 -羰基，Liu等［13］从正丁醇部分分离得到了6 个甾体硫酸盐;Levina等［14］从远东海星Henricia sanguinolenta和H.leviuscula leviuscula 中分离得到1 个新的三羟基甾酮化合物。本试验中，由于乙酸乙酯层和正丁醇层含有未萃取完全的脂溶性物质，故采用正向硅胶柱色谱进行进一步分离。将正丁醇层经过正向硅胶柱色谱后，按照其极性的大小，得到18 个溶剂。将其中的F 组分再次经过正向硅胶柱层析和Sephadex LH-20 柱色谱，得到F1～F88 个亚组分，利用展开剂［φ(氯仿)∶ φ(甲醇)=9∶ 1］对甾体化合物F3进行薄层色谱分析，结果显色后为单点(图2)。

图2 甾体化合物F3 的TLC 检测结果Fig.2 TLC of F3 steroid

2.2 海星中甾体化合物的鉴定

海星甾体化合物F3溶液出现了黄—红—紫—绿的颜色变化，L -B 反应为阳性，说明该化合物为甾体化合物。

2.3 海星各溶剂中甾体化合物的含量

以齐墩果酸标准品的吸光度(Y)为纵坐标，以标准品浓度(X)为横坐标，制得标准曲线，回归方程为Y=0.0024X -0.0225，相关系数R2=0.9994。根据标准曲线算出各溶剂中总甾体化合物的含量，其中，正丁醇层中总甾体化合物的含量最高，石油醚层中最低，仅为0.54 mg/g(图3)。

图3 海星各溶剂中总甾体化合物的含量Fig.3 The contents of steroids in all extracts from starfish

2.4 海星提取物对ACE 酶活性的抑制作用

海星提取物对ACE 酶的抑制作用随着样品浓度的降低而降低。如图4所示，海星乙醇粗提物、乙酸乙酯层和正丁醇层总甾体化合物对ACE 酶活性均具有明显的抑制作用，而石油醚粗提物的抑制作用则较低;浓度为100 mg/mL 的正丁醇层溶液对ACE 酶的抑制率最高，为78.05%。

图4 海星各溶剂中总甾体化合物对ACE 活性的抑制率Fig.4 The inhibitory activity of starfish extracts for ACE

半数抑制浓度(IC50)是指ACE 抑制率达到50%时的样品浓度。通过SPSS 17.0 软件分析可知:海星各溶剂中，石油醚层的IC50值最大，为182.71 mg/mL，说明石油醚层对ACE 的抑制效果不显著;正丁醇层的IC50值最小，仅为27.76 mg/mL;乙醇粗提物IC50值为39.84 mg/mL，乙酸乙酯层IC50值为36.27 mg/mL。

3 讨论

本试验中，为筛选具有抑制ACE 活性的甾体化合物，通过正向硅胶柱层析、SephadexTMLH -20柱层析和薄层层析对海星中甾体化合物进行提取、分离纯化。各溶剂中甾体化合物含量的测定结果和ACE 活性试验结果表明，石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层甾体化合物的含量依次增大，而各溶剂对ACE 酶的抑制率也依次增大，因此可推断，甾体化合物的含量可以影响ACE 酶的活性。

近年来，由高血压、高血脂引起的心脑血管疾病逐渐增多，高血压、高血脂现已成为人类健康的一大杀手［15-16］。ACE 酶既可以分解有缓解血管紧张作用的舒缓激肽，又可以产生血管紧张素，从而使血压上升，是高血压蛋白酶- 血管紧缩素(RAS)系统最重要的调节因子。ACE 抑制剂(ACEI)具有使血管扩张、降低血压的作用，从而改善糖代谢紊乱，是人们普遍使用的降血压药物，在治疗高血压的过程中发挥着一定的作用。从天然产物中得到的ACEI，作用温和、毒性小，可多途径、多靶点作用，因此，从海星中分离安全有效的降血压成分具有重要的意义。

海洋生物为适应海洋环境而产生的生物活性物质是陆地生物所不能及的。海星甾体化合物有降血压作用，它直接作用于血管系统，不受迷走神经分布的影响，非组织胺释放的结果或对独立的α 与β受体的作用，且与触角的传导和胆碱能作用无关。因此，海星甾体化合物可以作为降血压药物的有效成分，为新药和保健品的研制提供参考。

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