不同给药方式下培氟沙星在鲤体内的药代动力学研究

李改娟，刘艳辉，祖岫杰，鞠松柏，王文兰，陈伟强，刘铁钢

(吉林省水产科学研究院，吉林 长春130033)

鲤是中国的主要经济鱼类之一，细菌性鱼病是鲤养殖的主要限制因素，尤其是细菌出血性败血病最为严重，其主要致病菌为温和气单胞菌和嗜水气单胞菌。诺氟沙星［1-2］、恩诺沙星［3-4］、环丙沙星［5］等喹诺酮类药物已长期应用于鱼类细菌性疾病的防治，由于滥用、乱用药物现象严重，已导致鱼类细菌产生耐药性。培氟沙星(Pefloxacin)是第三代喹诺酮类药物，由于其分子基本结构中引入了疏水性的氟原子及亲水性的吡嗪环，在体内具有良好的组织渗透性，除脑组织和脑液外，在各组织和体液中均有良好的分布，不仅抗菌性能更强、更广谱(包括革兰氏阳性菌)，而且使用方便、成本低、治疗效果显著、不良反应少［6］，比早期喹诺酮类药物的细菌耐药性有所降低［7］。目前，培氟沙星已广泛应用于水产养殖中，但尚未见关于该类药物在鱼类体内药动学方面的报道，使用该类药物治疗水生动物的细菌性病时，大多是借鉴兽医对哺乳动物的研究成果，造成该类药物在水产业疾病防治用药的盲目性［8］。本研究中，进行了培氟沙星在福瑞鲤Cyprinus carpio 体内药代动力学研究，旨在指导临床合理用药，有效控制鱼类细菌性疾病。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用鲤由九台水产良种场提供，体质量为(200 ±30)g，共300 尾，试验前一周暂养在水族箱内。

试验试剂:乙腈(色谱纯)、KH2PO4、NaOH、HCOOH 均为分析纯;甲磺酸培氟沙星标准品由中国兽药监察所提供;培氟沙星原料药(含甲磺酸培氟沙星不少于98.0%)，由南京农牧高科生物技术有限公司提供。

试验仪器:超高液相色谱仪(Waters ACQUITY UPLC)、离心机(XiangYi L -550)、振荡器(IKA MS3 digital)、氮吹仪(HGC -24A)、Waters OasisR HLB 固相萃取柱等。

1.2 方法

1.2.1 肌肉注射给药及样品的采集 用生理盐水将甲磺酸培氟沙星配制成所需浓度，按照培氟沙星10 mg/kg(体质量)的剂量给每尾鲤肌肉注射，共注射150 尾，于给药后0.08、0.25、0.50、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120 h 时间点分别取6 尾鱼，自尾静脉采集血样，同时将鱼处死，取其肌肉、肝胰脏、肾脏等组织，继续于168、216、264、312、360、408 h 采集肌肉、肝胰脏、肾脏等组织。将采集的血样置于含1%肝素离心管中混匀、离心，分离上清液血浆，每个样品设6 个重复。血浆及各组织样品于-20 ℃下保存备用。

1.2.2 混饲口灌给药［9］及样品的采集 将培氟沙星溶解后混入饲料中，加水搅拌成糊状，配制成一定浓度。按照10 mg/kg(体质量)的剂量灌入每尾试验鱼的前肠，共口灌150 尾，无回吐者保留作为试验鱼。于给药后0.25 h 开始采集血液、肌肉、肝胰脏、肾脏样品，后期处理同上。

1.2.3 样品的前处理［10-13］

血浆样品:量取0.5 mL 血浆，加入5 mL 乙腈，振荡2 min，以4000 r/min离心10 min，转移上清液，再加5 mL 乙腈重复上述操作一次，合并上清液，在50 ℃下用氮气保护浓缩至近干，用流动相溶液定容至1.0 mL，待上机检测。

肌肉、肝胰脏、肾脏样品:称取2.0 g 剪碎的样品组织于50 mL 塑料离心管中，加入pH 为7.0(肝胰脏、肾脏用pH 为4.5)的PB 液10 mL，振荡2 min，以4000 r/min 离心10 min，转移上清液，重复上述操作一次，合并上清液，取合并上清液5.0 mL 过柱，将HLB 固相萃取柱预先依次用1 mL甲醇、1 mL 水活化，用1 mL 水淋洗、吹干，最后用1 mL 流动相洗脱，洗脱液过0.22 μm 滤膜后待超高液相色谱分析。

1.2.4 超高液相色谱(UPLC)的测定条件 色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱温为35 ℃，流速为0.4 mL/min，流动相为0.1%甲酸水溶液与乙腈的混合液(体积比为90∶ 10)，检测波长为280 nm，进样体积为3 μL。

1.2.5 线性范围和最低检出限 准确称取含10.0 mg 培氟沙星的甲磺酸培氟沙星标准品，用水定容至100 mL，配制成浓度为100 μg/mL 的母液，用流动相稀释为0.01、0.05、0.10、0.70、2.00、5.00、10.00 μg/mL 的标准使用液，用UPLC 进行测定，以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标做标准曲线，分别求出回归方程、相关系数。以引起3 倍信噪比(S/N≥3)的药物浓度为最低检出限。

1.2.6 回收率与精密度 对空白血浆、肌肉、肝胰脏、肾脏样品分别进行高、中、低3 组加标试验，然后按照“1.2.3”节中的方法进行处理后测定，回收率按下式计算:

上述样品于1 d 内重复测定5次，连续测定5 d，计算各浓度水平响应值峰面积的变异系数，以此衡量检测方法的精密度。

1.3 数据处理

药代动力学模型拟合及参数采用DAS 3.0和SPSS 软件进行计算。

2 结果

2.1 色谱方法验证［13］

采用本试验中的方法，血浆、肌肉、肝胰脏和肾脏中的杂质和标样峰分离良好，标样谱图中物质色谱峰尖锐且对称(图1)。

图1 标样谱图及鲤各组织空白谱图Fig.1 Chromatogram of pefloxacin standard solution and blank chromatogram in the issues of common carp

培氟沙星标准液在0.01 ～10.00 μg/mL 浓度范围内有良好的相关性，相关系数R2=0.999。血浆的检出限为0.01 μg/mL，肌肉、肝胰脏、肾脏的检出限均为20 μg/kg。各组织中培氟沙星回收率均在70% 以上。日内变异系数为0.13% ～1.95%，日间变异系数为2.11% ～4.50%。表明该试验的准确度和精密度均良好。

2.2 培氟沙星在鲤体内的药代动力学参数

按10 mg/kg(体质量)混饲口灌给药和肌注给药后，鲤血浆中培氟沙星的药动学参数见表1。

表1 不同给药方式下培氟沙星在鲤血浆中的药物代谢动力学参数Tab.1 Pharmacokinetics parameters of pefloxacin in plasma of the common carp challenged by different administration

2.3 不同给药方式下培氟沙星在各组织中的含量

从表2和表3可见:混饲口灌培氟沙星后鲤肌肉中的药物浓度于24 h 时达到峰值4536.25 μg/kg，之后处于消除阶段，直至408 h 时药物浓度为42.35 μg/kg;鲤肌注给药后肌肉中的药物浓度于6 h 时达到峰值5035.28 μg/kg。混饲口灌培氟沙星后肝胰脏中药物浓度于2 h 时达到峰值11 518.73 μg/kg;肌注给药比口灌给药提前达到峰值，其药物达峰时间为0.50 h，峰值为5456.30 μg/kg。混饲口灌后肾脏中药物浓度于2 h 时达到峰值13 192.74 μg/kg;肌注给药后肾脏中药物浓度于0.50 h 时达到峰值11 137.97 μg/kg。

表2 混饲口灌给药后培氟沙星在鲤各组织中的含量Tab.2 Mass concentration of pefloxacin in tissues of common carp with oral administration μg/kg

表3 肌肉注射给药后培氟沙星在鲤各组织中的含量Tab.3 Mass concentration of pefloxacin in tissues of the common carp challenged by intramuscular injection μg/kg

3 讨论

3.1 检测方法

建立可靠的分析方法是进行临床药代动力学研究的关键之一。目前，有关水产品中培氟沙星的测定标准有农业部1077 号公告-1—2008［14］和GB/T 21312—2007［15］，均采用液相色谱-串联质谱法，检出限较低，均为1.0 μg/kg。本试验中采用超高液相色谱法，检出限为20 μg/kg，但根据行业标准NY 5070—2002［16］水产品中渔药残留限量的规定，环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星的残留限量为50 μg/kg，但没有明确规定培氟沙星最高残留限量，若参照NY 5070—2002 中同类药物残留限量的规定，本试验中检出限即可满足要求。而且线性范围、回收率、精密度均能达到药代动力学试验要求。本试验中选用UPLC，3 min 即可检测一个样品，而使用HPLC 需要15 ～25 min，大大缩短了检测时间，减少了流动相的浪费，降低了有机溶剂对环境的污染，保护了操作人员的身体健康。

UPLC 超高的分析速度极大地提高了大批量样品的分析效率，而消耗时间较长的前处理环节成为了整个分析周期的瓶颈，如何尽量缩短样品前处理时间成为了亟需解决的问题之一［17］。本试验中，前处理过程操作简便快捷，利用磷酸二氢钾水溶液提取，取代了传统方法中使用的有机溶剂，安全无毒，解决了前处理时间长、杂质干扰的问题。本检测方法的建立，对于此类药物在鱼体中的药代动力学及其残留的研究均有一定的实际意义。

3.2 培氟沙星在鲤体内的药代动力学参数

从培氟沙星在鲤体内的药动学参数可以看出，不同给药方式对其药动学参数的影响比较大。培氟沙星混饲口灌给药后，经消化道消化进入血液，达峰时间比肌注给药晚，达峰浓度较肌注小;而肌注给药方式下消除半衰期较混饲口灌给药长，与血浆AUC 较大有关，这与张雅斌等［1］对诺氟沙星在鲤体内的药动学研究时得出的肌注给药时的t1/2(3.40 h)较混饲口服给药半衰期(2.02 h)长的结果相一致。李春雨等［4］研究表明，腹腔注射和口灌恩诺沙星后药物在鲤体内的药动学均符合一级消除二室模型，其血浆AUC 分别为59.185、600.296 μg·h/mL，Cmax分 别 为3.297、3.266 1 μg/mL，t1/2分别为96.545 6、168.287 1 h，表明口灌组血浆吸收要好于腹腔注射组，t1/2要比腹腔注射组时间长。杨雨辉等［5］研究表明，按10 mg/kg 混饲口服乳酸环丙沙星在鲤体内的药动学参数:AUC 为5.29 mg · h/L，t1/2为 14.47 h，Cmax为 0.70 μg/mL，Tmax为1.10 h。其AUC 明显小于本研究中混饲口灌给药时的AUC 值，AUC是衡量药物在体内吸收和分布的主要药动学参数，这说明培氟沙星在鲤体内的吸收较环丙沙星好，生物利用度高。本研究中，混饲口灌给药方式的Vd为5.464 L/kg，小于肌注方式的Vd(15.342 L/kg)，Vd可以反映药物分布的广泛程度或与组织中大分子的结合程度。Vd越小，说明药物排泄越快，在体内存留的时间短，而Vd越大，药物排泄越慢，在体内存留的时间越长，正好与半衰期的长短一致。

3.3 肌肉注射和混饲口灌培氟沙星后药物在鲤体内的分布和消除特征

从两种给药方式下培氟沙星在鱼体不同组织的药时含量可以看出，培氟沙星在各组织中的浓度均为开始逐渐上升达峰后逐渐下降的变化过程。同时也可以看出，肌肉注射给药后培氟沙星在鲤体内的达峰时间均小于混饲口灌给药，说明肌肉注射培氟沙星在鲤体内的分布速率快于口灌给药。同种给药方式下，肝胰脏和肾脏同时达峰，随后是肌肉，并且达峰时肝胰脏和肾脏组织中的峰浓度大于肌肉中的峰浓度。这可能是由于肝胰脏和肾脏渗透性好且血管丰富，所以药物首先分布在这些组织中，比在渗透性差、血管贫乏的肌肉中分布得多［18］。培氟沙星在鲤体内的分布规律与梁俊平等［19］报道的恩诺沙星在大菱鲆体内的分布特征一致。鲤肌注培氟沙星后的t1/2与梁俊平等［19］报道的大菱鲆肌注恩诺沙星t1/2(68.003 h)相差不多，与张雅斌等［1］报道的鲤肌注诺氟沙星后的t1/2(3.40 h)相差很大。鲤混饲口灌培氟沙星后的t1/2与梁俊平等［19］、张雅斌等［1］和李春雨等［4］报道的鲤口灌恩诺沙星后的t1/2相差均很大。这些差异可能是由于种属［20］、性别［21］、给药方式［22］等原因造成的，因此，造成水产动物药代动力学差异的原因非常复杂，须慎重分析其差异才能制定出合理的给药方案。

3.4 建议给药方案

培氟沙星作为第三代喹诺酮类药物，在水产养殖上主要作为内服药物混饲投喂。对于特殊的水产动物或特殊病例，可以采用注射或药浴方法，出于对环境保护的考虑，不允许在水体中泼洒给药。内服给药方案的制定，主要依据药物的药效学和在鱼体内药代动力学研究结果，以及生产应用效果。

刘艳辉等［23］对淡水鱼类细菌出血性败血病致病菌嗜水气单胞菌和温和气单胞菌进行了体外药效试验，培氟沙星均具有很好的抗菌活性，培氟沙星对两种菌的最小抑菌浓度(MIC)均为0.01 μg/mL。本试验结果表明，以10 mg/kg(体质量)的剂量给鱼肌肉注射和混饲口服培氟沙星，培氟沙星在鱼体中血药浓度迅速上升，肌注给药0.5 h 时药物即达到峰值，口灌给药4 h 达到峰值。而且药物在鱼体血液中维持有效浓度的时间长，从给药后0.17 h 到120 h 均在温和气单胞菌和嗜水气单胞菌的最小抑菌范围内。根据此试验结果和养殖生产的具体情况，确定给药次数为每日1次，即可防治鱼类细菌性出血病、打印病、烂鳃病、肠炎病、赤皮病和白头白嘴病等。考虑到药饵入水的散失和水产动物摄食的不确定性，制定给药方案时应该加大药量。培氟沙星用于防治细菌性疾病时，按每日每千克鱼体质量10 ～20 mg 的剂量，每日给药2次，连续混饲投喂5 ～7 d。药浴或注射，可用于特殊水产动物或特殊需要。药浴时，浓度为4 mg/L，时间为1 ～2 h;肌注时，剂量为5 mg/kg(体质量)，每日注射1次，3 ～5 d 为一疗程。

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