集约化猪场不同阶段仔猪猪瘟抗体水平检测与分析

江春春 ，张任娜 ，贾亚伟 ，韩少鹏 ，王苗苗 ，朱建国 *

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240；2.圣克鲁斯生物技术(上海）有限公司；3.江苏天兆实业有限公司，江苏 灌南 223500)

猪瘟又称古典猪瘟(CSF)，是由黄病毒科、瘟病毒属的猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，而猪是该病毒的唯一自然宿主［1］，由于造成的经济损失巨大，世界各国特别是养猪大国极为重视，世界动物卫生组织(OIE)将其列入必须上报的传染病之一。

近年来，许多养猪场反映猪瘟免疫状况不理想。决定免疫成败的原因是多方面的，而免疫程序是其中最重要的因素之一［2］。尤其是对于早期阶段的仔猪，母源抗体水平是制定免疫程序首要的考虑因素［3］。就国内养猪场来讲，猪瘟首免时间参差不齐，早晚不一。造成这种局面的原因主要是对于母源抗体消长时间认识不一致。鉴于此，我们用ELISA方法对某集约化猪场不同免疫阶段的仔猪猪瘟抗体进行了检测分析，之后同样检测分析了首免后及二免后的仔猪的猪瘟病毒抗体水平与免疫力状况，旨在为不同规模猪场制定科学、有效的猪瘟免疫程序提供借鉴。

1 材料

1.1 血清样本

某集约化猪场送检的一免前（4周龄），以及调整免疫程序一免后（6周龄）和二免后（10周龄）的仔猪血清。

1.2 检测试剂盒

IDEXX 猪瘟病毒抗体检测试剂盒，购于上海赛嘉生物科技有限公司。

2 检测方法及内容

2.1 猪瘟病毒抗体的检测方法及步骤

采用ELISA方法，用IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒，按照其说明书进行实验操作，结果判定：若被检样本的阻断率≥40%，该样本就可以被判为阳性；若被检样本的阻断率≤30%，该样本就可以被判为阴性。

1）在使用时，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温18～25 ℃。使用前应将各组分放置于室温条件下至少1 h。

2）分别将50μL 样品稀释液加入每个检测孔和对照孔中。

3）分别将50μL的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同对照的吸头要更换，以防污染。

4）分别将50μL的被检样品加入剩下的检测孔中，注意不同检样的吸头要分开，以防污染。

5）轻弹微量反应板或用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。

6）将微量反应板用封条封闭或于恒温湿箱中（18～25 ℃）孵育2 h，也可以将微量反应板用封条封闭或于恒温湿箱中孵育过夜。

7）吸出反应孔中的液体，并用稀释好的洗涤液洗涤3 次，注意每次洗涤时都要将洗涤液加满反应孔，弃去反应孔中的洗涤液并拍干反应板。也可以用洗板机洗涤3 次，每个反应孔应加300μL左右的洗涤液。注意洗板时要小心，以免样本之间的交叉污染。

8）分别将100μL辣根过氧化物酶(HRPO)的抗猪瘟病毒的酶标抗体（即取即用）加入反应孔中，用封条封闭反应板并于室温下或恒温湿箱中孵育30 min。

9）重复步骤7。

10）每个反应孔中加入100μL的底物溶液，并于避光、室温条件下放置10 min。加完第1孔后即可计时。

11)在反应孔中加入100μL的终止液终止反应。注意要按加酶标二抗的顺序加终止液。

12)在450 nm 处测定样本以及对照的吸光度值，也可用双波长（450 nm 和650 nm）测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。

13)计算样本和对照的平均吸光度值。

表 1 4周龄(一免前)仔猪猪瘟抗体(母源)水平检测结果

表 2 一免后（6周龄）和二免后（10周龄）仔猪猪瘟抗体水平检测结果

表3 对4周龄(一免前)仔猪猪瘟抗原水平检测

表4 对猪瘟一免和二免后仔猪的猪瘟抗原水平检测

2.2 检测内容

1)对4周龄(一免前)仔猪猪瘟抗体(母源)水平检测。

2)对猪瘟一免和二免后仔猪猪瘟抗体水平检测。

3）调整免疫程序（猪瘟首免由6周龄提前至4周龄）后猪瘟一免和二免后仔猪猪瘟抗体水平检测。

3 结果分析

3.1 4周龄(一免前)仔猪猪瘟抗体(母源)水平检测

由表1看出，4周龄（首免前）仔猪猪瘟（母源）抗体水平偏低，平均为38.75%。

3.2 调整免疫程序后仔猪猪瘟抗体水平检测

由表2 可看出，猪瘟首免由6周龄提前至4周龄后，其一免和二免的仔猪猪瘟抗体水平有明显的提高，平均值分别为55.3%和62.65%。

3.3 仔猪猪瘟抗原水平检测

1）由表3 可看出，对4周龄(一免前)的仔猪进行猪瘟抗原水平检测，有2个批次出现了猪瘟抗原阳性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出现了数量较多的可疑样品（7/30）。

2）由表4看出，调整免疫程序后对猪瘟一免和二免后仔猪的猪瘟抗原水平检测结果全部为阴性。

4 讨论

猪瘟母源抗体是指仔猪通过摄入分娩母猪初乳而获得的具有对猪瘟先天性保护的特异性免疫球蛋白。随着仔猪日龄的增长，母源抗体滴度缓慢下降，同时对猪瘟的先天性保护也随之降低[4]。而母源抗体持续时间和滴度直接决定了猪瘟首免时间，首次免疫过早，疫苗会被血清中尚处在较高水平的母源抗体抵消，难以发挥免疫作用，而首免过晚，无疑会使仔猪免疫出现低谷期甚至空档期，处在感染野毒的高风险期。

通过对集约化养猪场4周龄（首免前）仔猪猪瘟病毒抗体水平检测发现（表1），4周龄（首免前）仔猪猪瘟（母源）抗体水平偏低，平均为38.75%，这意味着此时仔猪群母源抗体对仔猪的保护力比较弱，如果不及时进行免疫，往往很容易发生猪瘟病毒的早期感染。在对4周龄仔猪血清进行猪瘟抗体检测的同时也检测了猪瘟抗原（表3），结果是有2个批次出现了猪瘟抗原阳性（2014年2月的13.33%和2014年3月的3%），而2013年12月出现了数量较多的可疑样品（7/30），而调整免疫程序后对猪瘟一免和二免后仔猪猪瘟抗原水平检测结果全部为阴性（表4）。这从一定程度上也说明此时仔猪群容易感染猪瘟野毒。鉴于此，该场及时调整免疫程序，将猪瘟首免由6周龄提前至4周龄，分别对猪瘟一免后（6周龄）和二免后（10周龄）的仔猪进行猪瘟病毒抗体检测，其一免和二免的仔猪猪瘟抗体水平有明显的提高，平均值分别为55.3%和62.65%。这意味着将首免提至4周龄后，6周龄的抗体水平肯定比调整前提高了；也说明该场调整猪瘟免疫程序，将首免时间由6周龄提前至4周龄对于改善仔猪猪瘟免疫状况有一定作用。

养猪业一直是我国畜牧业的支柱产业，是农村经济的重要组成部分。但大多数养殖户还缺乏根据猪场定期的抗体水平监测结果确定科学免疫程序的意识，主要依靠自身经验，或照搬他人程序，免疫程序混乱(如增加免疫密度、剂量、盲目超前免疫等)，致使猪瘟仍没有得到有效控制。猪瘟的免疫程序有多种，最合理的免疫程序应是每个猪场要根据自己猪场的实际情况(主要是猪瘟抗体水平变化规律)，并根据血清抗体监测结果及时调整制定符合本场实际的免疫程序。

[1］ 王火平．仔猪猪瘟超前免疫的研究[J].福建畜牧兽医，2005，27(4): 8-9.

[2] 苗得园．Herdchek猪瘟抗体ELISA试剂盒在猪瘟控制中的应用[J]．中国兽医杂志，2006，42(11)：50-51．

[3] KLnig M，Leng sfeld T，Pau iy T，et a1．Classical swine fever virus：mdependent induction of protective immunity by two structural glycoproteins[J]．J Virol，1995，69(10)：6479-6486．

[4] Terpstra C．The immunity against challenge with swine fever virus of piglets from sows vaccinated with C-strajnvaccine[J]． Tijdschrift Voor Diergeneeskunde(Amsterdam),1977,102:1293-1298.