贵州白香猪γ-干扰素真核表达质粒的构建

王伟丞，梁海英，曾智勇*，汤德元，刘 钊

（1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学教学实验场，贵阳 550025）

γ-干 扰 素 (interferon-gamma，IFN-γ)是由激活的T细胞和NK细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤、调节细胞生长和免疫功能的分泌型细胞因子[1-2]。IFN-γ具有激活NK细胞Th 1系列的辅助性T细胞以及CD8+T细胞等功能，因而也称为“免疫干扰素”。许多研究表明IFN-γ不仅能有效抑制病毒增殖且在细胞免疫中也起到重要的作用，具有较好的临床应用前景[3]。随着对IFN-γ功能研究的深入，目前国内也有对猪的γ-干扰素基因研究，但是对纯种猪特别是地方纯种猪γ-干扰素的研究还比较少。本研究在已构建好的含有贵州白香猪γ-干扰素基因的pMD-GZ-IFN-γ质粒基础上，构建其真核表达质粒，为研发新型抗病毒制剂和疫苗佐剂，以及贵州白香猪的疾病防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

pMD-GZ-IFN-γ（由贵州省动物疫病研究室构建保存）；pMD19-T Simple Vector〔购自宝生物工程（大连）有限公司〕；真核表达载体pcDNA3.1(+)（购自Invitrogen公司）；大肠杆菌感受态TOP10（贵州省动物疫病研究室制备和保存）。

1.2 主要试剂

限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ购自宝生物工程（大连）有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)胶回收试剂盒购自OMEGA公司；普通质粒小提试剂盒为TIANGEN公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成

根据阳性质粒pMD-GZ-IFN-γ设计一对特异性引物P1和P2，分别在其两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增用于表达的IFN-γ基因片段。

P1：5-CGGGATCCATGAGTTA TACAACTT-3；

P2：5-CGGAATTCTTATTTTG ATGCTCT-3。

为了便于克隆，分别在其两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点（划线部分）预期扩增大小为520 bp。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 IFN-γ基因PCR扩增

以pMD-GZ-IFN-γ质粒DNA为模版，用引物P1和P2进行IFN-γ基因扩增。PCR反应体系：pMD-GZIFN-γ1 μL，上下游引物各 2 μL，2×Taq PCR Mastermixture25 μL，ddH2O 0.5 μL。按以下条件进行反应：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35cycles；72 ℃ 10 min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 克隆质粒的构建

将回收纯化的PCR产物与pMD19-T Simple Vector载体按常规方法进行连接并转化感受态细胞TOP10。挑取白色菌落进行增菌培养，小剂量试剂盒提取质粒DNA，用质粒PCR和酶切分别进行鉴定，并将阳性克隆质粒送宝生物工程（大连）有限公司测序，命名为pMD19-IFN-γ。

1.6 真核表达质粒的构建

用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ对pMD19-IFN-γ测序质粒及载体pcDNA3.1(+)分别进酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜，连接产物转化TOP10感受态细胞，提取重组质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ，分别进行双酶切及质粒PCR鉴定后，并送宝生物工程（大连）有限公司测序。

2 结果

2.1 目的基因的扩增

以pMD-GZ-IFN-γ阳性质粒为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增IFN-γ基因，所获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，大小与预期片段520 bp相符（图1）。

2.2 克隆质粒pMD19-IFN-γ的鉴定

图1 IFN-γ的PCR扩增产物

图2 pMD19-IFN-γ的鉴定结果

重组质粒pMD19-IFN-γ经双酶切和PCR鉴定，均获得大小约520 bp的与预期片段大小一致的DNA片段（图2）。

2.3 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ的鉴定

p c D N A 3.1(+)-I F N-γ经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，在琼脂糖凝胶电泳中出现2条大小分别为5 400 bp和520 bp的目的DNA片段；以pcDNA3.1(+)-IFN-γ为模版，经PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳中出现一条大小约520 bp的条带（图3）。

由pcDNA3.1(+)-IFN-γ重组质粒DNA测序结果可知，IFN-γ基因已亚克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中，其开放阅读框为501 bp，可编码166个氨基酸，该序列与pMD-GZIFN-γ中IFN-γ序列（GenBank登录号：JF906510）完全一致。

图3 pcDNA3.1(+)-IFN-γ的鉴定结果

3 讨论

干扰素是由细胞分泌的一类具有广谱抗病毒、免疫调节等多种生物学功能的新型药物，应用前景较为广泛，主要着重于调节机体免疫功能，且其副作用少，因而在多种疾病的治疗上具有传统药物所不可替代的作用。干扰素还具有疫苗佐剂的作用，其不仅能特异性的增强疫苗的免疫效果，而且还可增强机体抗感染的能力[4]。

近年来，国内不断有用基因工程技术表达γ-干扰素的报道。娄忠子等构建了IFN-γ原核表达系统并在大肠杆菌系统实现了高效表达[5]。姚清侠等运用腺病毒载体，通过同源重组，首次成功研制了携带猪γ-干扰素的重组腺病毒[6]。目前基因工程生产细胞因子主要有原核表达系统和真核表达系统2种，因真核表达系统可以实现目的蛋白的分泌表达，且表达的蛋白不需要修饰，具有生物活性，而原核表达系统表达的目的蛋白常以包涵体形式存在，且翻译后加工修饰不完善，影响蛋白生物活性，所以真核表达系统产生细胞因子越来越受到重视[7]。

本研究中采用的pcDNA3.1(+)真核表达载体，携带有CMV强启动子，能够携带外源基因在哺乳动物细胞中高效转录表达。对pcDNA3.1(+)-IFN-γ质粒的测序表明，γ-干扰素基因已亚克隆至pcDNA3.1(+)中，成功构建了γ-干扰素真核表达载体，为IFN-γ基因的真核表达研究奠定了基础。

[1] 曾智勇，周莉，刘志杰，等. 贵州白香猪γ干扰素基因的克隆与序列分析[J].贵 州 农 业 科 学， 2012，40 (08)： 151-153.

[2] 杨生海，殷宏，刘永生，等. 干扰素-γ研究进展[J]. 生物技术通报 ，2010(08)：29-34.

[3] 夏伦斌，王新华，连宏军，等. γ干扰素及其在动物疾病防控中的应用[J]. 动物医学进展 ，2007，28(05)：74-78.

[4] 温纳相，陈瑞爱，裴仉福，等. 新兴猪γ-干扰素基因克隆及其真核表达质粒的构建 [J]. 动物医学进展， 2005， 26(09)：74-77.

[5] 娄忠子，兰喜，李建强，等. 猪γ-干扰素的克隆表达及单抗的潜在应用[J].生物技术通报，2010(01)： 173-179.

[6] 姚清侠，徐卓菲，何雁南，等. 表达猪γ干扰素的重组腺病毒的构建和活性鉴定 [J]. 病毒学报， 2007， 24(05)： 394-398.

[7] 肖红冉，王大伟，贺志锐，等. 猪α干扰素在BHK-21细胞中的表达与生物活性分析[J]. 石河子大学学报：自然科学版 ，2013， 31(02)：182-186.