高效液相色谱法测定发芽糙米中γ-氨基丁酸含量

程威威，周 婷，吴 跃，林亲录，丁玉琴，王晓映

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻米及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

发芽糙米是糙米经浸泡发芽后芽长达到一定长度的一种由糠层、胚芽及胚乳组成的糙米制品。糙米经发芽后，不仅口感得到改善[1]，而且其营养成分和功能因子大量富积[2]，尤其是γ-氨基丁酸，约是未发芽糙米的3 倍，精白米的10 倍[3-4]。因此，Wu Fengfeng等[5]预测发芽糙米可能成为21世纪很受欢迎的健康食品。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于动、植物体内，是高等动物神经系统中重要的抑制性传导物质。在体内其作为神经递质或神经递质的前体直接参与神经活动，具有促进脂肪消耗、降血压、改善睡眠质量、抑制癌细胞生长、促进脑部新陈代谢、抑制更年期自律失调及预防老年痴呆等功能[6]。因此，大量报道[7-8]是关于糙米发芽过程中GABA积累工艺的研究，而含量检测是各项工作的基础，尤为重要。近年来，国内外对GABA分析的研究越来越多，但由于它对电化学和紫外、可见光的不灵敏性，一些常规的直接测定法灵敏度较低。目前测定GABA的方法有改良的Berthelot比色法[9]、氨基酸分析仪法[10]、改良纸层析法[11]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、薄层扫描法[13]、分光光度法[14-15]等，其中柱前衍生HPLC法应用最广，其衍生方法有：丹磺酰氯法、氯甲酸芴甲酯法、异硫氰酸苯酯法、6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯法、邻苯二甲醛法，前4 种方法存在衍生过程复杂、速度慢或价格昂贵等缺点，而邻苯二甲醛法不仅试剂具有价格便宜，而且衍生时间短、衍生条件简单、过量试剂不干扰测定等优点，其应用最为广泛，且紫外检测器也是最常用的液相检测器。本实验以邻苯二甲醛为衍生试剂建立一种能快速、准确地检测发芽糙米中GABA含量的高效液相色谱-紫外分析方法，并对湖南省20种早籼稻品种发芽糙米中GABA含量进行测定分析及比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集湖南省20 种2012年产早籼稻品种：中嘉早17、湘早籼45、华两优164、株两优233、株两优611、湘早籼24、湘早籼17、准两优608、丰优1167、浙福802、金优233、两优527、湘早籼143、株两优268、株两优211、T优167、湘早籼42、凌两优942、株两优199、株两优819，其含水量在11.22%～13.41%，千粒质量为17.42～20.45 g，经分样筛去除杂物后，放置于4 ℃冰柜中。

GABA标品（纯度≥99%）、邻苯二甲醛 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 美国Tedia试剂公司；甲醇（色谱纯） 韩国SK公司；2-巯基乙醇 天津市光复精细化工研究所；无水乙酸钠、冰乙酸、硼酸（均为分析纯） 国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱分析仪（SPD-20A紫外检测器）日本岛津公司；RAZ-128A型人工气候箱 宁波江南仪器厂；L530型台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JLGJ4.5型检验砻谷机 浙江台州粮仪厂；QE-200 g型高速万能粉碎机 浙江屹立工贸有限公司；R-3型旋转蒸发仪 瑞士Büchi Labortecknic AG公司；AL204型分析天平、FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZOOMWO-L型超纯水系统湖南中沃水务环保科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发芽糙米的制备

从冰柜中取出除杂后的稻谷，经砻谷后人工精选出优质糙米，将其平铺于发芽纸上，置于37 ℃、95% RH的人工气候箱中培养10 h，50 ℃条件下干燥至水分含量14%左右，取出后置于－18 ℃冰箱中备用。

1.3.2 标准溶液的配制

称取50 mg的GABA标准品，用超纯水溶解并定容于50 mL的容量瓶中，振荡摇匀，配制成1 mg/mL的GABA标准溶液。分别稀释至0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 mg/mL的标准液，备用。

1.3.3 GABA样品液的制备

将1.3.1节制备的发芽糙米用粉碎机充分粉碎后过100 目筛（过筛率≥90%），然后称取3 g发芽糙米粉置于三角瓶中，加入50 mL 60%的乙醇溶液，水浴振荡3 h，4 000 r/min离心20 min，上清液移入茄形瓶中，重复上述操作，合并上清液，混合，浓缩至10 mL，备用。

1.3.4 邻苯二甲醛衍生液的制备

取10 mg邻苯二甲醛用0.5 mL甲醇溶解后，加入0.4 mol/L的硼酸缓冲液（pH 10.2）2 mL和2-巯基乙醇30 μL，4 ℃条件下可存放2 d。

1.3.5 衍生化反应

取发芽糙米样品或GABA标准液20 μL于样品瓶中，加入邻苯二甲醛衍生液100 μL，涡旋振荡5 s，静置2 min后，过0.45 μm滤膜，取10 μL进样。

1.3.6 色谱分析条件

色谱柱：Intertsil ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：流动相A为25 mmol/L的乙酸钠，用4%的乙酸调pH值至5.90±0.05；流动相B为纯乙腈；流速1 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；检测波长332 nm；梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution program

1.4 数据分析

HPLC色谱图采用岛津Labsolution工作站采集，使用SPSS 20.0软件对数据结果进行统计分析，Origin 8.6进行绘图。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

为提高分析灵敏度，选择最佳波长是关键，为此特配制0.04 mg/mL的GABA标准溶液，使其与邻苯二甲醛衍生液进行衍生，以没有添加GABA的空白液做比对，用紫外分光光度计进行光谱分析。GABA衍生物的紫外光谱扫描图如图1所示，GABA衍生物的最大吸收波长为332 nm。

图1 GABA衍生物的紫外扫描图Fig.1 UV spectrum of derivatized GABA

2.2 GABA的定性分析

在1.3.6节色谱分析条件下，在Intertsil ODS-C18柱上对衍生的标样和发芽糙米样品组分进行了有效地分离。不添加GABA的空白衍生液、标准品和发芽糙米样品的色谱图见图2。对比可见，GABA的保留时间为18.8 min左右；发芽糙米样品中其他共存氨基酸和杂质对目标物的测定无干扰。

图2 不添加GABA的空白衍生液（A）、标准品（B）和发芽糙米样品（C）的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank derivatization agent (A), standard substance (B) and germinated brown rice sample (C)

2.3 标准曲线的绘制

将0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 mg/mL GABA标准溶液分别衍生后进行色谱测定，以峰面积为横坐标X，以待测样品质量浓度为纵坐标Y/（mg/mL），绘制标准曲线（图5），得回归方程Y=9.26×106X＋2 093.79，回归系数r=0.999 5。由此说明，GABA的量在0.005～0.06 mg/mL之间时，本测定方法呈现良好的线性关系，以3 倍信噪比计算检出限为2.927 ng。

2.4 精密度实验

对同一发芽米样品平行实验5 次，并计算样品中GABA的平均含量、标准偏差和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表2所示，GABA衍生物峰面积的RSD为0.57%，GABA质量浓度的RSD为0.56%。

表2 精密度实验结果Table 2 Results of precision tests

2.5 回收率实验

分别取一定质量浓度的发芽糙米样品5 份，按待测样品液GABA含量的80%、100%、120%添加标准品，测定GABA含量，计算回收率。如表3所示，此HPLC色谱方法测定GABA的回收率达98.85%～100.94%。

表3 回收率实验结果Table 3 Results of recovery tests

2.6 发芽糙米样品测定

按1.3.5、1.3.6节样品衍生处理方法和色谱分析方法，随机抽取湖南省早籼稻品种20 种，相同条件下制备发芽糙米，分别测定各糙米样本中GABA含量，每个样品重复3 次，结果如图3所示。20 种发芽糙米中GABA含量在22.68～88.36 mg/100 g（干基）。可见，20 种发芽糙米中GABA含量不尽相同，如中嘉早17（88.36 mg/100 g）、浙福802（76.32 mg/100 g）中GABA含量明显高于其他；而株两优199、湘早籼143、株两优233及两优527中GABA含量则无明显差异（P＞0.05）。这与Karladee等[16]的结论具有一致性。

图3 20 种发芽糙米中GABA含量的测定结果Fig.3 GABA contents in germinated brown rice from 20 cultivars

3 结 论

本方法采用邻苯二甲醛为柱前衍生剂，反相高效液相-紫外检测器法测定发芽糙米中GABA的含量。与6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯法[12]、2,4-二硝基氟苯法[17]相比，该方法检测成本低，邻苯二甲醛价格便宜且用量较少；衍生过程在室温条件下进行，只需将邻苯二甲醛与GABA样品混合即可反应，操作较简单；反应用时短，仅需2 min；邻苯二甲醛毒性较小，故易于推广应用，回收率在99.18%～100.94%。张继红等[18]采用邻苯二甲醛作为衍生剂，RP-HPLC-荧光检测胚芽米中GABA含量，而本方法使用紫外检测器，更具有普通性和适用性，且精密度和回收率均较上述方法好。应用本方法测定湖南省20 种早籼品种发芽糙米中GABA含量，其结果为22.68～88.36 mg/100 g干基，得知发芽糙米中GABA含量因稻米品种的不同而含量不尽相同。在实际生产中，该结论可为发芽糙米副产品原料的选择提供参考。

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