马铃薯皮中绿原酸提取工艺优化

2014-02-13李次力刘天怡金瑱琪

食品科学 2014年12期

李次力，刘畅，刘天怡，金瑱琪，侯静

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨 150076）

马铃薯，别名土豆、洋芋，植物马铃薯是茄科茄属一年生草本。其块茎可供食用，是重要的粮食、蔬菜兼用作物，是世界四大粮食作物之一[1]。马铃薯具有丰富的营养，一般新鲜马铃薯中所含成分：淀粉9%～20%，脂肪0.1%～1.1%，粗纤维0.6%～0.8%。100 g马铃薯中所含的营养成分：热量66～113 J，钙11～60 mg，磷15～68 mg，铁0.4～4.8 mg，硫胺素0.03～0.07 mg，核黄素0.03～0.11 mg，尼克酸0.4～1.1 mg等。除此以外，马铃薯块茎还含有禾谷类粮食所没有的胡萝卜素和抗坏血酸[2-4]。

马铃薯鲜薯可供烧煮作为粮食或蔬菜。世界各国生产的马铃薯加工食品，如法式冻炸条、炸片、速溶全粉以及花样繁多的糕点、蛋卷等，为数达100多种[5-6]。对于加工马铃薯后的皮，作为废物丢弃。而马铃薯可作为抗衰老食物，是由于其中所含的酚类物质具有保健作用[7-8]。马铃薯块茎中总酚含量以干质量计在0.11%～0.13%之间，芽中含量高达0.18%，其中约90%是绿原酸[9]。酚类物质主要存在于马铃薯的皮和皮层之间，约有50%存在于皮及邻近的组织中，越靠近块茎的中心，浓度越低[10-11]。

绿原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeic acid）与奎尼酸（quhaoacid）组成的缩酚酸，异名咖啡靴酸，化学名3-O-咖啡酞奎尼酸（3-O-caffeoylquinic acid），是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[12]。绿原酸是食品、药品、化妆品等工业的重要原料。绿原酸具有广泛的生物活性，对自由基的清除和抗脂质过氧化作用显著，具有抗菌、抗病毒、抗诱变、保肝、利胆等多种药用功能[13-14]。

本实验尝试将对马铃薯鲜薯皮提取绿原酸并研究其功能性质，以期为充分利用我国马铃薯的资源优势、加快马铃薯及其副产物的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯皮麦肯食品（哈尔滨）有限公司。

无水乙醇、H2O2、抗坏血酸、KClO3均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ALC-3100.2型电子天平上海奕宇电子科技有限公司；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司；FW177型粉碎机南京莱步科技郑州有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅苏州江东精密仪器有限公司；752型紫外-可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；LC-20AB岛津高效液相色谱仪杭州瑞析科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将马铃薯皮洗净，放入电热鼓风干燥箱中80 ℃干燥，取出后用粉碎机粉碎成粉末，过40 目筛放入瓶中密封备用。

1.3.2 绿原酸的测定

1.3.2.1 标准曲线的测定

用天平准确称取绿原酸标准品0.005 g，用70%乙醇溶液溶解定容于100 mL的质量浓度为0.05 mg/mL标准液，摇匀，备用。

分别准确量取上述0.05 mg/mL的标准液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，70%乙醇溶液定容至10 mL，以空白试剂为对照，327 nm波长处测定吸光度，以绿原酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图[15]。绿原酸得率按式（1）计算：

式中：Y为绿原酸得率/（mg/g）；m1为绿原酸的质量/mg；m0为原料马铃薯皮粉的质量/g。

1.3.2.2 马铃薯皮中绿原酸的提取方法

采用乙醇回流提取法，提取方法如下：将索氏提取器的各部位充分洗涤并用蒸馏水清洗后烘干，然后将含有样品的滤纸筒放入索氏提取器的抽提筒内，连接已干燥至恒质量的脂肪烧瓶，由提取器冷凝管上端加入乙醇至瓶内容积的2/3处，通入冷凝水，将底瓶浸没在水浴中加热，用一小团脱脂棉轻轻塞入冷凝管上口。抽提完毕，回收乙醇，然后称质量[16-17]。

1.3.3 乙醇回流法提取绿原酸的条件优化

1.3.3.1 料液比的选择

取12 g马铃薯皮干粉放入滤纸筒内，然后分别取马铃薯皮干粉与乙醇之间的料液比为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18（g/mL）进行乙醇回流提取实验，75%乙醇溶液，95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，进行回收乙醇，最后将所得提取液分别定容至20 mL，然后以75%的乙醇溶液作为空白对照，放入紫外分光光度计中进行绿原酸含量测定。

1.3.3.2 乙醇体积分数的选择

分别配制70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液，取12 g马铃薯皮干粉，料液比1∶12、95 ℃水浴，回流3 次，提取完成后，进行回收乙醇，最后将所得提取液分别定容至20 mL，然后分别以75%、80%、85%、90%的乙醇溶液作为空白对照，放入紫外分光光度计中进行绿原酸含量的测定。

1.3.3.3 提取温度的选择

分别设定91、93、95、97、99 ℃的提取温度，取12 g马铃薯皮干粉，料液比1∶12、80%乙醇溶液，回流3 次提取完成后，进行回收乙醇，最后将所得提取液分别定容至20 mL，以85%乙醇溶液作为空白对照，放入紫外分光光度计中进行绿原酸含量的测定。

1.3.3.4 回流次数的选择

取12 g马铃薯皮干粉放入滤纸筒内，料液比为1∶12、80%乙醇溶液、95 ℃水浴，分别回流1、2、3、4、5 次进行乙醇回流提取实验，提取完成后，进行回收乙醇，最后将所得提取液分别定容至20 mL，然后以85%的乙醇溶液作为空白对照，放入紫外分光光度计中进行绿原酸含量的测定。

1.3.4 绿原酸提取正交试验

在单因素试验的基础上，选定因素水平，以料液比A、乙醇体积分数B、提取温度C、回流次数D为因素，设计四因素三水平L9（34），进行正交试验，优化组合。所选水平如表1所示。

表1 马铃薯皮中提取绿原酸正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design for the extraction of chlorogenic acid from potato peel

1.3.5 高效液相色谱法鉴定绿原酸[18-19]

分析条件：L a b C18分析柱：（2 5 0 m m×4.5 m m），流动相为乙腈∶柠檬酸缓冲溶液∶水（10∶20∶70，V/V），流速为1.0 mL/min，室温，进样量为20 μL，检测波长为324 nm。

利用高效液相色谱在相同色谱条件下，将标准溶液色谱图与样品色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的绿原酸。

1.3.6 绿原酸的抗氧化性分析

1.3.6.1 绿原酸对DPPH自由基的清除作用

配制浓度为20 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液保存于棕色瓶中（临用前现配）。向比色管中加入2.0 mL DPPH自由基乙醇溶液，2.0 mL不同质量浓度马铃薯绿原酸提取物，摇匀，室温条件下避光静置30 min，然后在517 nm波长处测定吸光度A1；用等体积乙醇代替样品，测定吸光度A0；以VC作为阳性对照品，以样品质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作样品质量浓度与DPPH自由基清除率关系曲线[20-21]。按照式（2）计算清除率：

1.3.6.2 绿原酸对羟自由基的清除作用

将8 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，6 mmol/L的H2O2溶液0.8 mL，蒸馏水0.5 mL，不同质量浓度的马铃薯绿原酸提取物1.0 mL，20 mmol/L水杨酸钠溶液0.2 mL混合，摇匀，置于37 ℃水浴中1 h，然后于562 nm波长处测定混合物吸光度A1；用等体积的蒸馏水代替样品溶液，其余不变，测定吸光度A0；以VC为阳性对照，相同方法进行测定[22-23]。按照式（3）计算马铃薯绿原酸提取物及VC对羟自由基的清除率：

2 结果与分析

2.1 绿原酸标准曲线的绘制

按标准曲线制作方法，得出绿原酸标准曲线，回归方程为y=67.4x＋0.001 4（相关系数R2=0.999 6），可见，绿原酸在0.001～0.005 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.2 提取绿原酸的单因素试验

2.2.1 料液比对绿原酸得率的影响

图1 料液比对绿原酸得率的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

由图1可以看出，绿原酸得率随提取液用量的增加而增大，当料液比为1∶12时，提取效果最佳，再增大提取液用量时，绿原酸的得率增长趋势平缓，说明马铃薯皮组织内的绝大部分绿原酸已浸出。有机溶剂与水的混合液可打断马铃薯酚类物质与蛋白质、多糖等物质的结合键，有利于其酚类物质的浸提。所以随着提取液用量的增加马铃薯酚类物质浸提率也增加；但当提取液用量增加到一定比例时，浸提率将趋于稳定[24]。从生产成本和提取效果两方面综合考虑，适宜的料液比为1∶12。

2.2.2 乙醇体积分数对绿原酸得率的影响

图2 乙醇体积分数对绿原酸得率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

由图2可以看出，绿原酸得率随着乙醇体积分数的增大而升高，在乙醇体积分80%时，提取效果最佳，但当大于80%时，得率下降。随着浸提时间的延长，马铃薯皮与溶剂充分接触，因而绿原酸得率随乙醇体积分数的增大而增大，但是当乙醇体积分数过大时，由于乙醇本身的特性，马铃薯皮组织内的一些绿原酸不易被高体积分数的乙醇提取，所以使得绿原酸的得率反而有所降低。所以提取绿原酸最适宜的乙醇体积分数为80%。

2.2.3 提取温度对绿原酸得率的影响

图3 提取温度对绿原酸得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

由图3可以看出，绿原酸得率随着提取温度的升高而升高，但是当达到95 ℃左右后又开始下降。绿原酸易溶于水，但当温度降低时，溶解性变差，所以温度太低不利绿原酸的溶出，随着温度的升高，分子运动速率加快，马铃薯皮与乙醇的传质作用加强[25]，但绿原酸不稳定，当温度过高时，会加速绿原酸的分解，并使其有效成分被破坏，绿原酸失活，使绿原酸的得率降低[26]。所以最适宜的提取温度为95 ℃。

2.2.4 回流次数对绿原酸得率的影响

由图4可以看出，绿原酸得率随着回流次数的增加而增大，当回流次数大于3 次时，绿原酸的得率变化不大，这可能是因为回流次数过少，马铃薯皮中的绿原酸未能充分溶出，随着回流次数的增加，绿原酸逐渐溶解到溶剂中，考虑到回流次数过多，溶剂的消耗量增大，所以最适宜的提取回流次数为3 次。

图4 回流次数对绿原酸得率的影响Fig.4 Effect of number of repeated extractions on the extraction yield of chlorogenic acid

2.3 正交试验优化绿原酸提取的最佳条件

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2、3可得，各因素对绿原酸得率的影响程度依次为C＞D＞B＞A，其中C为主要因素，D、B、A为次要因素，综上所述，A1B3C3D2为最佳提取工艺条件，即料液比1∶10、乙醇体积分数85%、提取温度97 ℃、回流3 次时，绿原酸得率最高，提取物经冷冻干燥得马铃薯皮绿原酸提取物粉末[17]。

2.4 验证实验

按正交试验确定的最佳提取工艺条件进行验证实验，绿原酸得率为2.229 mg/g，表明此正交试验得出的最优组是符合实际的。

2.5 高效液相色谱法鉴定绿原酸

对马铃薯皮提取液中是否含有绿原酸进行定性分析，标准样品的色谱图如图5所示，样品则选取了70%乙醇提取液进行谱图绘制，见图6。根据图5、6表明检测物均在10.211 min处出现最大吸收峰，可以初步断定两种物质为同一化合物。

图5 高效液相色谱绿原酸标准溶液色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid solution

图6 70%乙醇马铃薯皮提取液色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of 70% ethanol extract from potato peel

2.6 绿原酸的抗氧化性

2.6.1 马铃薯绿原酸对DPPH自由基的清除作用

图7 绿原酸及VC对DPPH自由基清除的作用Fig.7 DPPH radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

如图7所示，在实验质量浓度范围内，VC、绿原酸对DPPH自由基的清除作用随质量浓度升高逐渐增强，达到0.06 mg/mL后，清除率上升缓慢，质量浓度为0.2 mg/mL时，样品对DPPH自由基清除率最大，达到85.13%，VC达到90.12%。由此可以看出，绿原酸对DPPH自由基的清除作用与VC对其的清除作用相差不大，表明绿原酸具有较强的抗氧化能力。

2.6.2 绿原酸对羟自由基的清除作用

图8 绿原酸及VC对羟自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of chlorogenic acid and ascorbic acid

图8结果表明，在实验质量浓度范围内（0.02～0.5 mg/mL），绿原酸与VC对羟自由基表现出一定的抑制作用，并随着质量浓度的增加，清除率增大，当绿原酸质量浓度达到0.3 mg/mL后，清除率增加缓慢，当质量浓度为0.5 mg/mL时，绿原酸对羟自由基的清除率达到最大，为43.14%，VC对羟自由基的清除率为55.26%，表明绿原酸对羟自由基有一定的清除作用。

3 结论

本实验以马铃薯皮为原料，应用乙醇回流法提取其中的抗氧化物质绿原酸，采用单因素和正交试验来确定提取绿原酸得率的最佳工艺条件，并且将其应用到油脂中测其抗氧化效果。得到以下结论：1）料液比1∶10、乙醇体积分数85%、提取温度97℃、回流3次时马铃薯皮中绿原酸得率最高，即提取绿原酸的最优组合条件为A1B3C3D2。其中，对于绿原酸得率影响最大的因素是提取温度。2）绿原酸对于DPPH自由基、羟自由基有一定的清除作用，从而可以得知，本实验从马铃薯皮中提取的绿原酸具有一定的抗氧化性，证实了马铃薯皮中的确含有抗氧化物值得利用生产。

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