手性药物对映体分离检测的研究式开放性实验*

谢天尧 刘丹 赖瑢 戴宗 陈六平 巢晖

(中山大学化学与化学工程学院 广东广州510275)

手性药物在药物中占很大的比例，其在生物体内的吸收、分布和代谢均体现出立体选择性，不同对映体往往显示出不同的药理学和毒理学特性［1］。由于对映异构体除旋光性不同外，在非手性环境中的物理化学性质完全相同，用一般的方法难以分离，因此手性药物对映体的分离检测是分析化学研究的热点和难点之一［2］。目前，手性药物对映体的分离检测一般采用高效液相色谱(HPLC)。但由于HPLC存在手性色谱柱价格昂贵，色谱柱难冲洗、易损坏，溶剂消耗量大和维护成本较高等缺点［2］，在很大程度上限制了采用HPLC技术开展手性药物对映体分离检测的实验教学(在国内高校的仪器分析实验中几乎是空白)。毛细管电泳(CE)结合电容耦合非接触式电导检测(C4D)的新型分离分析方法具有通用、灵敏、适用性强、易维护等优点;CE-C4D具有的高效、试剂消耗少、环境友好、分析成本低等特点使其在手性化合物的分离分析中极具应用前景［2-3］。

在大学化学实验教学中，开设研究式开放性实验是培养学生综合实验能力、创新能力以及社会适应能力的有效途径［4-7］。通过研究式开放性实验，学生既可以把基础化学的理论知识和各种实验技能及方法有机地结合起来，教师也可以将科学研究中获得的新知识及时地融入到实验教学环节中，不断地更新教学内容。学生可以在做这类实验的过程中探索研究的方法和获取新知识。本文介绍的“毛细管电泳/非接触式电导分离检测手性药物氧氟沙星对映体”实验，是我们仪器分析实验教学小组在科研成果基础上开发出来的，并已经过我院4届本科生的实际教学经验积累的一个研究式开放性实验。

1 实验目的

熟悉高效毛细管电泳仪的基本原理和操作使用。了解毛细管电泳分离检测手性药物对映体的原理。学习和掌握手性药物氧氟沙星对映体的CE-C4D分离检测技术。

2 实验原理

氧氟沙星(Ofloxacin，OFLX)是第3代喹诺酮类药，属于手性药物，其对映体的分子结构如图1所示。目前临床使用的为外消旋体氧氟沙星和光学纯体的左旋氧氟沙星(S-OFLX)。左旋氧氟沙星的抗菌活性是右旋(R-OFLX)的8～128倍［8］。在羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)构建的二元手性选择剂体系中，HP-β-CD与R，S-OFLX形成主-客体结构包结物，由于HP-β-CD具有多个手性中心，能与对映体之间存在较好的手性选择作用，使得两个对映体在电泳淌度上表现出明显的差异。HPMC属水溶性非离子型纤维素醚，是甲基纤维素中部分甲氧基被羟丙氧基置换时得到的产物，具有手性协同作用，可以进一步稳定HP-β-CD包含物和增加HP-β-CD的手性识别能力和选择性，进而继续增加对映体在电泳淌度上的差异，从而实现对映体的CE-C4D基线分离和检测。

图1 氧氟沙星对映体的分子结构示意图

3 仪器与试剂

CES2008毛细管电泳仪(配备CES2008-C4D/CD-1B型双通道电导检测器，中山大学化学与化学工程学院研制)，熔融石英毛细管(di=50μm，Leff=40cm);超声波清洗器。0.45μm尼龙滤膜滤头。

HAc，NaAc，HP-β-CD，HPMC，氧氟沙星对照品，市售左旋氧氟沙星片剂和氧氟沙星片剂，所用试剂为分析纯，水为超纯水。

电泳运行液:20mmol/L HAc+6mmol/L NaAc+12mg/L HPMC+35mmol/L HP-β-CD。

4 实验内容

4.1 石英毛细管的处理

在使用前，依次用0.1mol/L的氢氧化钠溶液、超纯水和电泳运行液分别冲洗毛细管柱5min，在超声波清洗器中清洗进样瓶和储液瓶。每两次进样之间，用电泳运行液冲洗毛细管柱3min，以保证良好的重现性。实验结束后，要用超纯水清洗进样瓶、储液瓶和毛细管。

4.2 样品前处理

取市售左旋氧氟沙星和外消旋体氧氟沙星药片各一片(标示含量0.100g/片)，分别放入50mL容量瓶中，加入约25mL超纯水，在超声波清洗器中助溶3min，定容。药液经过0.45μm的滤膜过滤。取1.25mL滤液于25mL的容量瓶中，定容。进样时，用50μmol/L HAc+5mmol/L HP-β-CD稀释到合适浓度，进行CE-C4D分析。

4.3 实验条件及仪器参数

在毛细管电泳/非接触式电导分离检测手性药物氧氟沙星对映体的实验中，影响实验结果的因素较多。如:手性选择剂和电泳运行液的组成和浓度，分离电压，进样电压，进样时间等。在这些影响因素中，有些涉及对映体的分离度，有些涉及分析方法的精密度和重现性;有些是关键因素，有些是次要因素。学生带着研究性质进行实验，可以对这些影响因素有全面的认识，在实验过程中就能感到思路清晰。

仪器的参数为:分离电压为+13kV，电动进样:+11kV，8s。检测器的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理、图形显示和数据文件存储。实验在室温、相对湿度＜70%的条件下进行。

4.4 样品分析及结果

在选定的实验条件下，按4.2节方法处理实际样品和进样分析。样品分析分为定性分析和定量分析两部分。在定性分析步骤中，通过标准加入法确定CE-C4D谱图中与R，S-OFLX分别对应的电泳峰。结果表明，S-OFLX出峰在前，R-OFLX出峰在后(图2)。为消除基体干扰，可用标准加入法或采用药片辅料作为空白的标准曲线法计算片剂中氧氟沙星和左氧氟沙星的含量，两种方法之间不存在显著性差异。我们对某厂家同一批次的氧氟沙星药片测定结果分别为0.103g/片和0.098g/片，与标示值0.100g/片一致。

图2 手性药物氧氟沙星片剂的对映体分离CE-C4D谱图

5 教学实施及教学效果

由于本实验内容较多，具有一定的复杂性和综合度，因此将全部学生分成若干个小组，每组4～5人，每个小组指定一名小组长负责与教师联络。各小组独立开展工作，小组内学生既有分工，又有合作。学生确定目标后，即着手查资料，研读文献。在此基础上，先由学生提出实验方案，经与教师讨论修改后，即可开始实验。实验结束后，要求每个学生独立完成实验报告。实验报告的最后部分是思考题，要求学生解答电泳运行液中各组分所起的作用，电泳谱图中各电泳峰的归属和成因;并对本文方法与文献方法的优缺点进行分析。

实验室对学生全天开放(包括周末)，学生只要有时间，就可以到实验室做实验。学生带着自己设计的方案进行实验，实验过程中既可以发挥集体的智慧，又能发挥学生个人的主观能动性。学生可以利用学校图书馆、校园网络查阅和收集参考资料，汲取自己所需要的知识信息解决实际问题;并运用所学过的理论知识和实验技能，达到实验所设定的目标，经历了知识转化为实际工作能力的过程。这一过程培养了学生解决问题的能力，可使他们正确运用网络资源，体会到探索的乐趣。

这个研究式开放性实验具有效率高、试剂消耗少、分析成本低的优点。目前在中山大学化学学院经过多年仪器分析实验教学实践，深受学生的欢迎，取得了良好的教学效果。

［1］黄量，戴立信.手性药物的化学与生物学.北京:化学工业出版社，2002

［2］汪尔康.分析化学新进展.北京:科学出版社，2006

［3］北京大学化学系.仪器分析教程.第2版.北京:北京大学出版社，2007

［4］施开良，姚天扬，俞庆森.大学化学，2002，17(6):8

［5］施开良，姚天扬.中国高等教育，2003，17:27

［6］段连运，华彤文.大学化学，2005，20(6):5

［7］侯文华，丁维平，王志林.大学化学，2010，25(3):7

［8］国家药典委员会编.中国药典(2005版).北京:化学工业出版社，2005