急性脑梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low调节性T细胞表达及其临床意义

陈晓菲，许文华，任明山

急性脑梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low调节性T细胞表达及其临床意义

陈晓菲，许文华，任明山

目的动态观察急性脑梗死患者不同时期外周血单个核细胞（PBMC）中CD4＋CD25＋CD127low调节性T细胞（Treg）表达，探讨其对急性缺血性脑卒中免疫状态及病程进展的影响。方法选取急性脑梗死患者60例为脑卒中组，并分为发病24～48 h组（n＝16）、3～7 d组（n＝22）和8～14 d组（n＝22）；另选取健康体检者22例为对照组。采用流式细胞术检测60例急性脑梗死患者和22例健康体检者外周血中CD4＋CD25＋CD127lowTreg水平并进行分析。结果与对照组比较，脑卒中组外周血CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋CD25highTreg比例在起病后24～48 h、3～7 d时显著降低（P＜0.01）；8～14 d逐渐恢复至正常水平，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，脑卒中组的CD4＋T细胞比例升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论Treg可能参与急性缺血性脑卒中的病理生理过程，其功能失衡在急性缺血性脑卒中炎性损伤中具有重要作用，早期检测可能为其治疗提供依据。

脑缺血；卒中；CD4＋CD25＋调节性T细胞；CD127；流式细胞术

调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是具有免疫无反应和免疫抑制两大功能特征的具有免疫调节活性的T细胞亚群，其在免疫稳态、移植反应、过敏反应、肿瘤免疫和微生物感染等方面均具有重要的免疫调节功能。叉头翼螺旋转录因子Foxp3特别表达于CD4＋CD25＋Treg，是其特异性标志物。但由于Foxp3是一种细胞核内成分，检测时需要固定破膜，并不能用于分离人类Treg细胞以作功能性研究，因此限制了其在人类中的应用［1］。最近的研究［2－3］表明，CD4＋CD25highCD127lowT细胞是目前人类外周血中自然发生的Treg细胞最好的膜标志物。低表达的IL-7Rα链（CD127）与高表达的IL-2受体的α链（CD25）结合能够更好地分离和鉴定具有高抑制功能的纯化Treg亚群［4－5］。因此，采用CD25high和CD127low这对标志物进行临床研究将能够更精确地描述急性脑梗死患者Treg的调节功能。该研究通过动态检测急性脑梗死患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中CD4＋CD25＋CD127lowTreg的表达，从而进一步揭示急性缺血性脑卒中的免疫相关发病机制，为发现新的治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2013年1月～5月安徽医科大学附属省立医院神经内科住院的脑梗死患者60例，作为脑卒中组，其中男41例，女19例，年龄43 ～80（61.50±10.69）岁。其中发病24～48 h组16例，3～7 d组22例，8～14 d组22例。疾病诊断符合第四届全国脑血管病会议修订标准，全部病例均经头部CT和（或）MRI证实。其中包括各种不同部位的脑梗死病例。所有患者均为24 h内的初次发病患者，且无心、肝、肾疾病及糖尿病，无自身免疫性疾病，排除颅内其他病变，近期无其他感染性疾病。另设对照组22例，其中男15例，女7例，年龄44～80（59.63±9.81）岁，均系无心、肝、脑、肾和免疫、感染性疾病及糖尿病的健康成年人，头部MRI检查无颅内疾病。脑卒中组与对照组在年龄和性别上均匹配，具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD4单抗（克隆号13B8.2）、藻红蛋白（PE）标记的CD25单抗（克隆号U7.27）和CD25同型阴性对照试剂购自美国Beckman-Coulter公司；PE标记的CD127单抗（克隆号hiL-7R-M21）购自美国eBioscience公司；溶血剂为0.83%的氯化铵溶液，由本院中心实验室用去离子蒸馏水自行配制。流式细胞仪购自美国BD公司（型号BD FACSCalibur），荧光激发波长为488 nm和635 nm，分析软件为CellQuest Pro系统。

1.3 流式细胞仪检测受试者均于清晨空腹状态下抽取肘静脉血2～3 ml，肝素抗凝，标本在采集后2 h内测定。检测时取抗凝全血100 μl，加入CD25-PE、CD4-FITC各10 μl及CD127-PE 2.5 μl，震荡器上充分混匀，室温避光反应15 min；加入溶血剂2 ml，充分震荡混匀，室温避光反应10 min，加入生理盐水2 ml，1 500 r／min离心5 min弃上清液，取500 μl立即上流式细胞仪检测。每次检测前常规用荧光微球和同型阴性对照试剂对仪器进行质量监测和调控，并用标准方法对各荧光素之间的干扰进行补偿，排除相互干扰。检测时先根据前向角和侧向角散射光信号，对淋巴细胞群进行设门，每次获取设门内细胞20 000个以上并保存数据。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据均符合正态分布，以±s表示，多组样本间采用单因素方差分析进行检验。

2 结果

2.1 急性脑梗死患者和健康体检者外周血CD4＋CD25＋CD127lowT细胞、CD4＋CD25highT细胞水平比较结果显示，与对照组比较，脑卒中组外周血CD4＋CD25＋CD127lowT细胞、CD4＋CD25highT细胞占CD4＋T细胞比例在起病后24～48 h、3～7 d时显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；8～14 d则逐渐恢复至正常水平，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图1、2。

2.2 急性脑梗死患者和健康体检者外周血CD4＋T细胞水平比较结果显示，与对照组比较，脑卒中组外周血CD4＋T细胞占淋巴细胞比例在起病后24 ～48 h、3～7 d、8～14 d时均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同组中CD4＋CD25high、CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋T细胞的检测结果（%，±s）

表1 不同组中CD4＋CD25high、CD4＋CD25＋CD127low、CD4＋T细胞的检测结果（%，±s）

与对照组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01

组别nCD4＋CD25high／CD4＋CD4＋／CD4＋CD25＋CD127low／CD4＋淋巴细胞脑卒中24～48 h160.67±0.33△△4.56±0.96△△35.24±7.74△3～7 d220.77±0.31△△4.51±0.64△△37.72±11.53△8～14 d220.95±0.235.25±1.3036.96±11.29△对照220.96±0.145.35±0.5527.58±7.03

图1 各组外周血CD4＋CD25＋CD127lowTreg表达

图2 各组外周血CD4＋CD25highTreg表达

3 讨论

近来研究［6］显示，脑卒中的病理过程正如炎症性肠病、继发性血管炎、类风湿关节炎或抗磷脂综合征等一样，也是一个复杂的全身炎症性疾病或自身免疫过程。该研究表明炎性免疫反应可能在急性缺血性脑损伤中具有重要作用，卒中后的免疫抑制成为当今治疗急性缺血性脑损伤的重要靶点。

CD4＋CD25＋Treg是指部分高表达IL-2受体的α链（CD25）分子的CD4＋T细胞［7］，是一类具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，能够通过免疫负性调节的方式来抑制自身反应性T细胞的效应，负向调节机体的免疫炎症反应，维持免疫耐受。Foxp3是其特异性细胞标志物，但人Treg不同于小鼠，其表型非常复杂。最近的研究［8－10］结果显示，在4个潜在的Treg种群中，人外周血CD4＋CD25＋CD127lowT细胞的Foxp3更容易表达，其中CD25highCD127low／－T细胞包含最多的Foxp3，并且表明在分离的CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞中有95%表达Foxp3，不表达Foxp3的是CD4＋CD25－T细胞。这表明CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞是目前发现的最能表达高水平Foxp3的标志物，更适用于人类外周血中Treg的功能性研究。

Liesz et al［11］首次提出CD4＋CD25＋Treg在急性缺血性卒中方面起到关键作用，并指出其可抑制急性缺血后促炎因子表达的上调及阻止中性粒细胞、淋巴细胞与小胶质细胞的活化和向大脑的入侵，从而减轻脑组织免疫炎性损伤的发生。本临床实验结果显示，急性脑梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞和CD4＋CD25highT细胞比例在24 ～48 h及1～3 d时均较健康体检者下降，以后逐渐上升，至8～14 d时与健康体检者已无明显差异。该研究表明在急性脑梗死后早期阶段，炎性免疫反应以促炎反应为主，促炎因子过度激活，效应T细胞过度活化，使Treg相对性减少，抑制了Treg活化分化，正是由于Treg免疫抑制能力的下降，这些发挥免疫保护作用的Treg数量和功能的抑制加重了炎性反应所致的脑组织二次损伤。提示CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞对缺血性脑损伤具有保护作用，其功能下调导致了缺血性脑损伤进一步加重。

目前，CD4＋CD25＋Treg表达水平在缺血性脑卒中方面的研究仅见动物实验报道。杨双文等［12］研究发现，实验小鼠短暂性脑缺血后，脾脏单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋T细胞在缺血再灌注24 h时比例较对照组明显减少，但在72 h时基本恢复正常，5 d时则明显高于对照组，且这些变化与脑梗死容积变化密切相关。陈瑞清等［13］研究发现，外周血中CD4＋CD25＋Treg在大鼠脑缺血后1、3 d时表达与对照组无明显差异，而到7 d时表达高于对照组，以后逐渐上升，到14 d时则明显高于对照组。这些实验研究结果提示CD4＋CD25＋Treg与脑梗死发病后的病理变化具有明确的因果关系，其基本的变化趋势为CD4＋CD25＋Treg表达水平在脑梗死发病后早起即降低，后期逐渐升高。但在后期升高的时间点和升高的水平方面存在争议，这可能与选取的实验对象分别是人和动物有关、以及表面标记物的选择及检测手段方法不同有关。

新的免疫学理论认为，CD4＋T细胞在不同的理化因素作用下可分化成如辅助性T细胞1（Th1）、辅助性T细胞2（Th2）、Treg和辅助性T细胞17 （Th17）等不同功能的细胞亚群。本研究结果显示，与健康体检者相比，急性脑梗死患者的CD4＋T细胞比例明显增高。可能由于卒中后损伤所导致的血脑屏障破坏，使得平时隐含的特殊的中枢神经系统抗原暴露于免疫系统并得以进入体循环，从而可能造成自身免疫性损伤。与此同时，急性脑梗死患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞和CD4＋CD25highT细胞比例在发病24～48 h及3～7 d较健康体检者下降，该研究表明在急性脑梗死急性期免疫炎性反应被激活，CD4＋T细胞可能以诱导分化成促炎细胞因子为主，而具有免疫抑制功能的Treg数量和功能则受到抑制，从而加重了脑组织损伤。而患者外周血CD4＋CD25＋CD127low／－T细胞和CD4＋CD25highT细胞比例在发病8～14 d逐渐恢复至正常水平，则可能在缺血性脑卒中恢复期，机体内诱导产生大量的Treg，从而抑制免疫炎性反应的发生，促进脑组织神经元的修复。

总之，急性脑梗死患者急性期存在免疫耐受缺陷，Treg功能失衡是急性缺血性脑卒中免疫功能紊乱的重要因素，CD4＋CD25＋CD127lowTreg作为一种具有免疫炎症负性调节作用的T细胞亚群，对缺血性脑卒中后脑组织具有保护作用，本结果为进一步阐明急性缺血性脑卒中的免疫机制提供了新证据，为卒中后免疫抑制治疗提供理论基础。

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Clinical significance of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells expression in the peripheral blood of patients with acute cerebral infarction

Chen Xiaofei，Xu Wenhua，Ren Mingshan
（Dept of Neurology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo investigate the expression of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells（PBMNCs）in order to explore the influence on the immune status and disease progression in the different period of acute ischemic stroke.Methods60 patients with acute cerebral infarction were selected as the stroke group，and divided them into the 24～48 h group（n＝16），3～7 d group（n＝22）and 8～14 d group（n ＝22）；22 healthy human were set as the control group.To analyze the percentage of CD4＋CD25＋CD127lowregulatory T cells in the peripheral blood of acute cerebral infarction patients and healthy human with flow cytometry.ResultsThe percentages of CD4＋CD25＋CD127lowand CD4＋CD25highregulatory T cells in the peripheral blood of the stroke group were significantly decreased at 24～48 h，3～7 d（P＜0.01）when compared with the control group，and then tended to return toward the control value at 8～14 d（P＞0.05）；the percentage of CD4＋regulatory T cells in the peripheral blood of the stroke group was significantly higher than control group（P＜0.05）.ConclusionImbalance of regulatory T cells is very likely to play an important role in the immunological injury of acute ischemic stroke.Regulatory T cells may be involved in the pathogenesis of acute ischemic stroke，and early detection may provide a basis for treatment.

cerebral ischemia；stroke；CD4＋CD25＋regulatory T cells；CD127；flow cytometry

R 743.3

1000－1492（2014）05－0633－04

2013－11－15接收

国家自然科学基金（编号：81000550）

安徽医科大学附属省立医院神经内科，合肥 230001

陈晓菲，女，硕士研究生；

任明山，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：renmingshan 2012＠163.com