翼状胬肉中血管内皮生长因子、内皮抑素的表达以及新生血管生成情况

彭 畅，蒋正轩，梁 坤，陶黎明

翼状胬肉中血管内皮生长因子、内皮抑素的表达以及新生血管生成情况

彭 畅1，蒋正轩2，梁 坤2，陶黎明2

目的 通过研究翼状胬肉组织中新生血管数量、促进血管生成因子以及抑制血管生长因子的表达情况，探讨翼状胬肉组织中促进血管形成和抑制血管生成的情况。方法手术获得正常的结膜组织35例（对照组）及翼状胬肉组织40例（实验组），用免疫组化及Western blot的方法分别检测两组样本中新生血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）、内皮抑素（Endostatin）的表达情况。其中，CD31是标记组织MVD的指标。结果 ①免疫组化法结果显示:在翼状胬肉组织中MVD的含量明显高于正常结膜组织;VEGF在正常球结膜组织中仅有少量阳性表达，在翼状胬肉组织中阳性细胞明显增多，着色显著加深;翼状胬肉组织中上皮细胞基底细胞层中的Endostatin抗原阳性表达则明显少于正常球结膜组织。②Western blot结果显示人正常球结膜与翼状胬肉中VEGF及Endostatin蛋白表达存在差异。翼状胬肉组织中VEGF蛋白/β-actin（1.46±0.59）显著高于正常球结膜组/β-actin（0.46±0.45），差异有统计学意义（P＜0.05）;翼状胬肉组织中Endostatin蛋白/β-actin（0.58±0.11）显著低于正常球结膜组/β-actin（1.54±0.12），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 在翼状胬肉中发现其MVD及促血管生长因子的表达高于正常结膜组织，而血管抑制因子的表达含量降低，这一血管平衡的打破可能是翼状胬肉的发病基础之一。

翼状胬肉;血管平衡;血管内皮生长因子;内皮抑素

翼状胬肉是我国常见眼表疾病之一，为睑裂部球结膜与角膜上的一种赘生组织，其侵犯角膜后日渐增大，甚至覆盖瞳孔区。该病不仅严重影响患者的外观，还可因其牵拉角膜作用而引起眼部不适及角膜散光，同时可不同程度地影响眼球运动，严重影响视力及视觉质量［1］。目前，翼状胬肉的发病机制尚不完全清楚。既往观点认为翼状胬肉是一种增生性、变性疾病。最近的研究［2］表明，翼状胬肉主要表现为纤维血管组织的大量增生，且侵袭力较强，破坏了角膜缘的结构，并侵入角膜内呈进行性生长。因此，在翼状胬肉发病过程中，新生血管在其中发挥了重要的作用，抑制血管生长因子和促进血管生长因子之间的平衡打破可能是该病的主要原因之一。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是重要的血管生成素之一，而内皮抑素（Endostatin）在体外实验中被认为是具有抑制血管内皮细胞增生作用的因子［3］。然而，这种具有血管内皮抑制剂作用的因子尚未在翼状胬肉中组织中被证实。该研究利用免疫组化及Western blot的方法检测翼状胬肉及正常的球结膜组织中血管相关因子及新生血管的表达差异，从而进一步探索血管相关性因素在翼状胬肉发病机制中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 标本 手术获得40例（男19例，女21例）翼状胬肉组织，患者平均年龄53.2岁;正常球结膜取自患有白内障和（或）斜视疾病，而无翼状胬肉的患者35例（男13例，女12例），平均年龄65.4岁。术前裂隙灯检查排除所有的参与者其他角结膜性疾病，手术过程中排除由局麻药、药物或化学因素引起的影响。研究经安徽医科大学伦理委员会批准，所有参加本研究的翼状胬肉患者和对照组患者均在知情同意的前提下签署相应知情同意书。

1.2 试剂 鼠抗VEGF、兔抗CD31多克隆抗体、二步法免疫组化检测试剂、DAB试剂盒、β-actin均购自北京中杉金桥生物技术有限公司;兔抗血管Endostatin多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;VEGF一抗购自美国SANTA CRUZ公司;Endostatin一抗购自武汉美国Bioworld Technology公司;二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本分组 40例翼状胬肉标本作为实验组，35例正常球结膜组织作为对照组，两组均采用Western blot法及免疫组化法检测相关蛋白。

1.3.2 病理学检查 翼状胬肉及正常球结膜组织用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，分别做常规组织切片，HE染色，镜下观察并比较各组织的病理状况。

1.3.3 免疫组化检测VEGF、Endostatin及CD31蛋白表达 翼状胬肉及正常球结膜组织分别用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，标记后切片。采用二步法染色，主要步骤如下:常规脱蜡，水化组织切片;3%过氧化氢去离子水孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗;滴加一抗，4℃过夜，PBS冲洗2 min，共3次;滴加通用型IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20 min，PBS冲洗2 min，共3次;DAB显色，苏木精复染，封片观察。在光学显微镜下进行染色参数分析，量化蛋白表达并做统计。

1.3.4 Western blot法检测 VEGF、Endostatin 蛋白表达 每组分别取约100 mg组织，加入裂解液（1 ml组织细胞裂解液 +10 μl PMSF，剪碎并研磨组织，冰上操作，持续30 min，将组织研磨成匀浆。吸取组织匀浆于事先标记好的EP管中，4℃下12 000 r/min离心40 min，取上清液进行蛋白定量。每组取50 mg匀浆蛋白，加入10%或12%SDS上样缓冲液，加热后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭 30 min，并分别用 VEGF（1∶200）或Endostatin（1∶250）多克隆抗体室温孵育1 h，ECL显色，扫描分析两组蛋白质表达相对含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料均以±s表示;定量资料用双侧t检验，计数资料用χ2检验。

2 结果

2.1 人正常球结膜与翼状胬肉组织病理学变化

HE染色显示:对照组表层上皮细胞排列整齐，基底上皮细胞边界清晰，间质少量血管;实验组上皮层增厚，表层上皮细胞排列紊乱，细胞体积增大，基底上皮边界模糊，间质中大量新生血管。见图1。

图1 人正常球结膜与翼状胬肉组织病理学观察 HE×200

2.2 人正常球结膜与翼状胬肉中VEGF、Endostatin及CD31的表达差异 免疫组化结果显示:VEGF抗原阳性表达主要位于上皮细胞基底部及血管内皮细胞之中，呈棕黄色分布。正常球结膜组织中仅有少量阳性表达，几乎不可见。实验组阳性细胞明显增多，着色显著加深。见图2 A1、A2。而翼状胬肉组织中上皮细胞基底细胞层中的Endostatin抗原阳性表达则明显少于正常球结膜组织。见图2 B1、B2。在实验组中由CD31标记的新生血管为21.19±4.13，而对照组为15.12±2.99，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2 C1、C2。

图2 人正常球结膜与翼状胬肉中VEGF、Endostatin及CD31的表达

2.3 人正常球结膜与翼状胬肉中VEGF及Endostatin蛋白表达变化 Western blot结果显示:实验组VEGF蛋白（1.46±0.59）显著高于对照组（0.46±0.45），差异有统计学意义（F=6 554.72，P＜0.05）。实验组Endostatin蛋白（0.58±0.11）显著低于对照组（1.54±0.12），差异有统计学意义（F=6 352.37，P＜0.05）。见图3。

3 讨论

图3 正常球结膜与翼状胬肉中VEGF及Endostatin蛋白的表达

翼状胬肉是眼科常见的慢性炎症性病变，被认为是一种因角膜缘干细胞受损，病变的结膜组织不断生长，最终侵入角膜，其主要表现为慢性充血及向结膜浸润性生长。目前临床主要治疗方式为翼状胬肉切除术，术后复发率较高［4］。目前研究［5］显示，新生血管在翼状胬肉中发挥重要作用，翼状胬肉中大量VEGF及新生血管的表达表明新生血管的发生是翼状胬肉形成的重要机制。另一方面，具有抑制血管内皮细胞增生作用的因子，如Endostatin蛋白的表达却很少在翼状胬肉组织及正常球结膜组织之间做比较，因此该研究进一步验证血管平衡的改变在翼状胬肉发病机制中发挥的作用。

本研究通过临床手术获得翼状胬肉及正常球结膜组织，分为实验组及对照组。HE染色显示，与对照组相比，实验组上皮层增厚，上皮细胞排列紊乱，细胞体积有增大趋势，上皮基底部呈不规则样改变，组织间质中新生血管数量增加。这些病理改变可能与翼状胬肉发病中增殖与凋亡的平衡被打破有关［6］;但增殖及凋亡因素不能完全解释该病的发生，随后的研究［4］显示，翼状胬肉组织中血管的异常表达可能是该病的重要发生机制之一。在新生血管的发生过程中，有两种因素参与其中。一方面，组织中促进血管生长因子的增加有关，如VEGF［7］、成纤维细胞生长因子［8］等，其中来源于角膜成纤维细胞的VEGF，能够促进组织毛细血管群的形成，目前被认为是新生血管生成的最重要的生长因子之一［9］。另一方面，Endostatin作为胶原Ⅹ、Ⅷ的羧基末端片段，是目前发现的一种强有力的血管抑制因子，能特异性抑制血管内皮细胞增生，从而抑制血管新生。其表达情况存在于正常的皮肤组织中，而较少存在于血管丰富的异常组织中［10］。而在人类正常球结膜组织中及翼状胬肉组织中，这一蛋白从未被检测。

免疫组化法结果显示对照组球结膜组织上皮细胞及血管间质细胞中VEGF表达较少，胞质淡染，而上皮基底细胞中Endostatin着色显著加深，阳性表达明显高于实验组。然而，人类翼状胬肉组织上皮细胞及血管内皮细胞中VEGF着色较深，而表达Endostatin蛋白的细胞数较少，且胞质色淡。这一结果表明，翼状胬肉中的血管平衡被打破，导致血管大量增生，最终引起疾病。Western blot结果均与上述一致，进一步证实了这一结论。此外，实验组与对照组中MVD的表达同样存在差异，表明可能由于血管平衡被打破，促进血管增加的因子增多，而抑制血管增加的因子减少，导致翼状胬肉中新生血管数量明显提高。因此，翼状胬肉可能是由于血管失衡—VEGF表达增加，而Endostatin表达降低，最终导致了翼状胬肉的发生。这一结果将为抗血管治疗人类翼状胬肉这一眼表常见疾病提供了新的理论依据。

［1］李淑琳.翼状胬肉发病机制的研究进展［J］.眼科研究，2009，27（3）:248－52.

［2］Bradley J C，Yang W，Bradley R H，et al.The science of pterygia［J］.Br J Ophthalmol，2010，94（7）:815－20.

［3］Bai Y J，Huang L Z，Zhou A Y，et al.Antiangiogenesis effects of endostatin in retinal neovascularization［J］.J Ocul Pharmacol T-her，2013，29（7）:619－26.

［4］宋寅伟.翼状胬肉新生血管形成机制及其治疗的研究进展［J］.中华实验眼科杂志，2012，30（2）:172－5.

［5］Todani A，Melki S A.Pterygium:current concepts in pathogenesis and treatment［J］.Int Ophthalmol Clin，2009，49（1）:21－30.

［6］Liang K，Jiang Z，Ding B Q，et al.Expression of cell proliferation and apoptosis biomarkers in pterygia and normal conjunctiva［J］.Mol Vis，2011，17:1687－93.

［7］周 舟，李瑞庄，庞燕华，等.SDF-1与VEGF在翼状胬肉中的表达及意义［J］.山东医学，2011，32（9）:1154－7.

［8］桑爱民，陆 宏.翼状胬肉bFGF TNF-α p53表达的研究［J］.中国实用眼科杂志，2010，28（10）:1136－9.

［9］Liang K，Jiang Z，Zhao B，et al.The expression of vascular endothelial growth factor in mast cells promotes the neovascularisation of human pterygia［J］.Br J Ophthalmol，2012，96（9）:1246－51.

［10］Mogili N S，Krishnaswamy V R，Jayaraman M，et al.Altered angiogenic balance in keloids:a key to therapeutic intervention［J］.Transl Res，2012，159（3）:182－9.

Expressions of vascular endothelial growth factor，endostatin and microvessel density in pterygia tissues

Peng Chang1，Jiang Zhengxuan2，Liang Kun2，et al
（1Dept of Graduate School，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Ophthalmology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230601）

ObjectiveTo investigate the angiogenic imbalance in pterygium tissues of Chinese patients.MethodsForty pterygia and thirty-five normal bulbar conjunctivas were obtained.Proangiogenic and antiangiogenic factors such as vascular endothelial growth factor（VEGF）and endostatin were texted by immunohistochemical and western-blot.And microvessel density（MVD）was evaluated with immunoassaying for CD31.ResultsOur study revealed that the positive rate of VEGF significantly increased in the pterygium samples compared to the normal conjunctiva samples.Immunohistochemical staining of pterygium tissues indicated less intense staining of endostatin in pterygium comparing normal bulbar conjunctivas.And microvessel density was higher in the pterygium tissues than normal conjunctiva.ConclusionThe finding of high levels of proangiogenic factors and low levels of antiangiogenic factors in pterygia confirm that both proangiogenic and antiangiogenic factors are known to play an important role in human pterygium pathogenesis.

angiogenic balance;pterygia;vascular endothelial growth factor;endostatin

R 777.33

A

1000－1492（2014）05－0645－04

2014－02－17接收

安徽省自然科学基金项目（编号:1208085MH178）;安徽省高校自然科学基金重点项目（编号:KJ2013A147）;安徽医科大学校基金（编号:2013xkj024）

1安徽医科大学研究生学院，合肥 230032

2安徽医科大学第二附属医院眼科，合肥 230601

彭 畅，女，硕士研究生;

陶黎明，男，主任医师，教授，博士生导师，责任作者，E-mail:Taolimingchina@126.com