H19 在骨肉瘤中的表达及其与预后的关系

张海军 袁治国 白登彦

H19 在骨肉瘤中的表达及其与预后的关系

张海军 袁治国 白登彦

目的本实验旨在研究骨肉瘤组织中 H19 基因的特异性表达模式，探讨其在骨肉瘤发生发展、浸润转移中的作用及其与预后的关系。方法收集并筛选出 2009 年至 2010 年就诊的骨肉瘤患者手术切除标本 30 例，采集临床指标包括患者性别、年龄、发病部位、大小、Enneking 分期、组织病理学分型、有无肺转移及术后随访患者生存情况。应用 PCR、RT-PCR 及限制性内切酶 ( AluI ) 酶切等方法，检测 30 例骨肉瘤组织中 H19 基因的印迹状态，分析 H19 基因印迹丢失及其与骨肉瘤各临床病理因素参数之间的关系。结果( 1 ) H19 基因印迹丢失率在骨肉瘤组织中为 41.67%，瘤近旁组织中为 16.67%，瘤远旁组织中为 8.33%。Kappa相关分析结果表明，上述不同组织中 H19 基因印迹丢失的发生频率间存在显著相关性 ( P＜0.05 )。( 2 ) 单因素方差分析结果表明，H19 基因的印迹丢失与骨肉瘤患者 Ennecking 分期、肺转移灶的存在与否有关 ( P＜0.05 )，而与患者的性别、年龄、部位、大小和病理分型无关 ( P＞0.05 )。( 3 ) Log-rank 单因素生存分析表明，H19 基因印迹丢失、肿瘤分期、病理学分类及转移灶的存在与否和骨肉瘤患者预后相关 ( P＜0.05 )，而性别、年龄、发病部位与患者预后无关 ( P＞0.05 )。H19 基因印迹丢失骨肉瘤患者的生存率明显降低，其差异具有统计学意义 ( P＜0.05 ) 。结论骨肉瘤组织中 H19 基因印迹状态的改变，对骨肉瘤的发生发展、浸润转移起重要作用并与患者的不良预后相关，可能成为预测患者预后情况的新靶点。

基因表达调控，肿瘤；骨肉瘤；预后；H19 基因

骨肉瘤是间叶源的实体恶性肿瘤，是最常发生于青少年的高侵袭性的骨原发性恶性肿瘤，其血运丰富、早期即可发生广泛的肺转移、死亡率高、预后很差。目前，虽已使用了新辅助化疗和广泛手术切除相结合的治疗手段，但 5 年无病总生存率约65%[1]，而且这个比例进入平台期已有 30 年余，寻找诊断、治疗骨肉瘤相关的靶点，已经成为现阶段的研究热点。目前的观点认为，骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程，但确切的发病机制尚未阐明。既往对骨肉瘤的研究主要集中于遗传学层面，发现 RB、p16INK4、p14ARF 和 MDM等多个基因的扩增、重组和点突变与骨肉瘤密切相关。但随着肿瘤病因学研究的逐步深入，人们认识到肿瘤不仅仅是一种遗传性疾病，同时也是一种表遗传性疾病，几乎所有人类肿瘤中都有表观遗传的异常。其中基因印迹，作为一种表遗传学机制，在肿瘤演进中发挥重要作用。

基因印迹是一种不遵循孟德尔定律的遗传现象，使不同亲本起源的等位基因具有不同的表达特性，具有这种现象的基因称为印迹基因。H19 基因是一个单一表达母系基因的具有印迹特征的基因，和人胰岛素生长因子 2 ( IGF2 ) 基因是一对在正常人胚胎组织中表现为印迹特征的基因。在某些病理情况下，由于印迹状态的基因得到了重新表达，称为印迹丢失 ( loss of imprinting，LOI )，从而引起了一系列病理生理改变甚至肿瘤的发生。近年来的研究表明，印迹丢失与胚胎发育及肿瘤的发生高度相关，肾母细胞瘤 ( Wilms’ tumor )、肝癌[2]、乳腺癌[3]、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌[4]和肺癌等多种肿瘤中都发现了 H19 基因印迹丢失的现象。查阅国内外文献，鲜见骨肉瘤中 H19 基因印迹状态的研究。本研究根据 H19 基因第五外显子的 AluI位点多态性特点，对骨肉瘤组织行聚合酶链反应( PCR )、逆转录 PCR ( RT-PCR ) 及片段长度多态性( RFLP ) 分析，以观察骨肉瘤组织中 H19 印迹状态及其与骨肉瘤各临床病理学参数之间的可能关系，进而探讨 H19 基因 LOI 在骨肉瘤发生、发展机制中的作用。

资料与方法

一、临床资料

30 例骨肉瘤组织和配对的非肿瘤组织收自2009 年至 2010 年的骨肉瘤手术切除标本，均经病理检查证实，配对的非肿瘤组织又分为瘤近旁组织 ( 距肿瘤边缘＜3 cm )、瘤远旁组织 ( 距肿瘤边缘＞5 cm )，所有患者术前均未进行放、化疗。其中男 17 例，女 13 例；年龄 5～55 岁，中位年龄25 岁；按 Ennecking 分期：I 期 6 例，II 期 9 例，III 期 15 例；肿瘤部位在胫骨 10 例，股骨 12 例，其它部位 8 例；肺转移者 16 例，无转移者 14 例。所有组织样本均保存于液氮中，用以进行 H19 基因印迹分析。本研究入组患者均签署知情同意书，患者的临床病理资料包括年龄、性别等，从病史记录及病理报告中收集。

二、方法

1. 主要试剂：逆转录酶及 RT 试剂购自上海invitrogen 公司，Taq 酶、限制性内切酶 AluI 及有关PCR 试剂购自大连宝生物公司。H19 引物由北京赛百盛公司合成，序列如下：F：5’-TCAGGAATCGGCTCTGGAAG-3’，R：5’-ATGATGTGGTGGCTGGTGGT-3’，产生的片段为 247bp。

2. DNA 和 RNA 的提取：DNA 抽提采取常规苯酚 / 氯仿 / 异戊醇法，RNA 抽提采用异硫氰酸胍 / 苯酚 / 氯仿一步法。

3. PCR-RFLP 及其杂合性分析：PCR 反应体系包括 10×缓冲液 2.5 μl、25 mmol / L MgCl23.0 μl、10 mmol / L dNTP 1.0 μl、5 μmol / L 引物 ( 各 1.0 μl )、去离子水 13.5 μl、模板 ( cDNA 或 DNA ) 2 μl、Taq酶 1U，总体积 25 μl。扩增条件为：94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共 30 个循环。将扩增的 PCR 产物进行胶回收，产物溶解于 20 μl的 TE 中，取 4 μl 用足量 AluI ( 20 U / 20 μl ) 在 37 ℃下消化 6 h 以上，以保证酶切完全，酶切产物沉淀后进行琼脂糖电泳分析。H19 PCR 产物为 247bp，经 AluI 消化只出现 247bp 或 105bp 和 142bp 条带，提示两条等位基因有相同的 AluI 内切位点，为纯合子 ( A / A )，故不作分析；若酶切后产生三条条带 ( 247bp，105bp 和 142bp )，则为杂合子 ( A / B ) (图1 )，图中顶层数字代表骨肉瘤标本的编号。进一步观察其 RT-PCR 酶切后的产物特征。每例临床标本瘤与远瘤组织均呈杂合状态时，判定该标本为杂合子，可以用于基因印迹状态检测；否则该标本不能用于基因印迹状态检测。

4. RT-PCR-RFLP 及印迹状态分析：对经 PCRPFLP 筛选出的杂合子标本，取 3 μg 总 RNA，加入Random Primers 和 β-actin 使其终浓度为 20 μM，以 DEPC 处理的水补足体积至 20 μl；70 ℃ 预变性5 min，迅速在冰上冷却 5 min；再加入 5×Reaction buffer 5 μl，2.5 mM dNTP 3 μl，200 U M-MLV 及RNasin，加灭菌水至总体积 25 μl；42 ℃ 水浴 1 h，80 ℃ 孵育 15 min 灭火 M-MLV，立即进行 PCR 或-20 ℃ 保存备用；取 3 μl 上述逆转录产物为模板，其余反应体系及反应条件同前，同时取未经逆转录的 RNA 为模板进行 PCR，如果不能扩出产物则说明RNA 模板中可能混有的基因组 DNA 已经消化完全，不会干扰印迹分析；取 5 μl 产物进行琼脂糖凝胶电泳，其余产物经乙醇沉淀回收后用于限制性内切酶消化反应。取 4 μl，用足量 AluI ( 20 U / 20 μl ) 在37 ℃ 下消化 6 h 以上，酶切沉淀后进行琼脂糖电泳分析。酶切后若为 247bp 或 105bp 和 142bp 条带，则为单等位基因表达，即正常印迹；若为 3 条不同的条带 ( 247bp，105bp 和 142bp )，则为双等位基因表达，即 LOI (图2 )，图中顶层数字代表骨肉瘤标本的编号。

三、随访

对所有患者进行电话、信件随访，随访时间以首次发病至死亡时间或最后一次随访时间为间隔时间，随访截止时间为 2012 年 12 月 31 日，随访 8～30 个月，入组患者 1 例失访 ( 失访率 3.3%， 1 / 30 )，其中生存 12 例，死亡 17 例。

图1 PCR-RFLP 法检测骨肉瘤中 H19 基因杂合性Fig.1 The heterozygosity of H19 gene in osteosarcoma detected by PCR-Restricted Fragment Length Polymorphism ( PCR-RFLP )

图2 RT-PCR-RFLP 法检测骨肉瘤中 H19 基因印迹状态Fig.2 The imprinting status of H19 gene in osteosarcoma detected by RT-PCR-RFLP

四、统计分析

计量数据以 x-±s 表示。多组数据均值比较采用单因素方差分析，两个样本均值比较采用 t 检验，分析基因表达与临床病理参数的关系用卡方检验，Kappa 检验进行相关性分析，所有数据均用 SPSS15.0 软件分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、H19 基因在骨肉瘤组织中的表达

在 30 例骨肉瘤组织中有 12 例为杂合子 ( 数据不显示 )。对所有杂合子个体进行 RT-PCR-RFLP分析发现，在被检的 12 例杂合子标本中，H19 基因 LOI 在瘤组织、近瘤组织和远瘤组织中的发生率分别为 41.67% ( 5 例 )、16.67% ( 2 例 ) 和 8.33% ( 1 例 )。从外围正常组织至病变瘤组织，LOI 的发生频率渐次上升。Kappa 相关分析结果表明，上述不同组织中 LOI 的发生频率间存在显著相关性。

二、H19 基因表达及其与骨肉瘤临床病理指标的关系

30 例骨肉瘤组织中，H19 基因表达与 Ennecking分期 ( P＝0.034 )、肺转移 ( P＝0.034 ) 有关，其差异有统计学意义，而与性别 ( P＝0.681 )、年龄 ( P＝1.276 )、部位 ( P＝0.758 )、大小 ( P＝1.021 ) 和病理分型无关 ( P＝0.204 ) (表1 )。

三、生存分析

所有患者均随访，2 年总生存率为 41.38% ( 死亡 17 例，存活 12 例，1 例失访未统计 )。本研究结果发现 H19 基因印迹丢失患者的生存率明显降低( P＝0.034 )。

表1 骨肉瘤 H19 基因表达及临床病理参数的关系Tab.1 The relationship between the expressions of H19 gene and clinicopathological parameters in osteosarcoma

讨 论

基因印迹是对基因或基因所在的染色体的外在修饰，存在于配子或结合子中，可引起来自父母的等位基因在后代体细胞中的不同表达。传统的孟德尔规律指出，胚胎从父亲和母亲遗传的两个拷贝即等位基因 ( Alleles ) 均有同等的机会表达而与其亲代来源无关，但近年来发现一小部分基因的表达取决于这些基因是源自父亲还是母亲，这种等位基因表达取决于亲本来源的现象即是基因印迹，也称亲代印迹或配子印迹。研究发现，印迹基因具有原癌基因或抑癌基因功能，其相当于功能上的单倍体，仅需一次打击就可引起以原癌基因或抑癌基因身份发挥作用的印迹基因功能异常，从而增加了肿瘤发生的易感性。基因印迹丢失就意味着在正常情况下静默的等位基因异常开放表达，比如胰岛素样生长因子 -2 ( IGF2 ) 基因；或者正常情况下表达的等位基因异常静默，比如 p57KIP2[5]。越来越多的研究表明，印迹基因异常是某些恶性肿瘤重要的分子生物学特征，这种基因突变的调控异常可能是癌变机制中的重要环节。

H19 基因属于发育印迹基因，正常情况下为父源印迹母源表达。H19 基因定位于小鼠 7 号染色体的远端、定位人染色体 11p15.5，为一单拷贝基因，人类 H19 基因全长为 3kb，共含有 5 个外显子及4 个内含子。因在体内以及各种细胞系中都检测不到任何与这些开放阅读框相对应的蛋白质产物，而且尚未发现 H19 基因与翻译系统有联系，因此大多学者认为 H19 基因是目前发现的唯一不表达蛋白质的印迹基因，在 mRNA 水平发挥其作用[6]。H19 基因与以往发现的 p53、Rb 等基因一样均为抑癌基因，在许多肿瘤细胞株研究中发现，H19 基因的丢失和突变率均超过了 p53 基因的突变率。

不仅如此，国内外众多学者就其与肿瘤的关系已进行了广泛而深入的研究：Ayesh 等[7]发现 H19 mRNA 能使许多基因表达上调，而这些基因与肿瘤细胞的侵袭、迁徙和血管形成有密切的关系；Ariel等[8]早期研究发现 H19 转录产物为肿瘤胚胎 RNA，且和 AFP 一样可作为肝癌的标记物应用于临床；Tanos 等[9]研究发现 H19 的过表达对食道癌及结直肠癌细胞的生长很重要；王文玲等[10]研究发现 H19在宫颈癌组织中的表达阳性率明显高于宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织，并且 H19 的表达与肿瘤的恶性程度及术后复发明显相关，可作为判断宫颈癌术后早期复发的检测指标。Berteaux 等[4]研究发现H19 基因对细胞周期活动及状态有一定影响。

本研究通过检测骨肉瘤瘤组织、瘤近旁组织及瘤远旁组织的 H19 基因印迹状态及其表达，发现H19 基因 LOI 率自瘤组织、瘤近旁组织至瘤远旁组织渐次下降，且相互间存在显著相关性，提示 H19基因 LOI 很可能是肿瘤发生的早期事件，并贯穿于正常细胞向恶性细胞转化的全过程。对其他肿瘤的研究表明，H19 基因 LOI 的形成与该基因母系等位基因上启动子的低甲基化及印迹控制区段的高甲基化密切相关，然而，骨肉瘤中 LOI 的形成是否基于同样的原理，尚有待进一步的阐明。此外，本研究还发现，有肺转移的骨肉瘤患者其 H19 基因 LOI 的出现频率明显高于无肺转移患者，Ennecking 分期III 期的骨肉瘤患者其 H19 基因 LOI 的出现频率明显高于 I 期、II 期患者，提示 LOI 与骨肉瘤的发展过程也密切相关，而与骨肉瘤患者的性别、年龄、部位、大小和病理分型无关，这与文献报道结果一致。不仅如此，研究结果显示 H19 基因 LOI 患者生存率明显降低，这可能对骨肉瘤患者预后判断有一定的参考价值。

此外，Arima 等[11]研究发现，在绒毛膜癌中，H19 基因的启动子突变，允许它克服了启动子 CpG甲基化的转录抑制，从而导致 H19 基因的表达上调。遗憾的是，在骨肉瘤中尚无对上述机制的研究报道。相信随着相关研究的进一步扩大和深入，对骨肉瘤生长的作用机制及其在临床诊断、分期中的作用将被进一步阐明。由 H19 基因与 DT-A ( 白喉毒素 ) 构成的 DTA-H19 作为膀胱癌、卵巢癌和胰腺癌的免疫治疗方式已经进入临床实验阶段，由此也将为临床上设计针对好 H19 基因印迹异常的特异性表观遗传靶向治疗和预防手段提供重要线索。不仅如此，由于 H19 基因印迹现象在胚胎发育初期就已形成，既不受时间 ( 年龄 ) 的推移[12]及其它环境致癌因素的影响[13]，又可从正常组织中测知，因此认为，LOI 现象作为肿瘤发生的一种新机制，其是否可以作为临床上肿瘤分期诊断及患者预后评估的指标还有待于进一步的研究。

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( 本文编辑：王永刚 )

Expressions of H19 in osteosarcoma and its relationship with the prognosis

ZHANG Hai-jun, YUAN Zhi-guo, BAI Deng-yan. Department of Orthopaedics, the second People’s Hospital of Gansu Province, Lanzhou, Gansu, 730000, PRC

ObjectiveTo study the specifc expression pattern of H19 gene in osteosarcoma tissues, and to explore its role in the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of osteosarcoma and its relationship with the prognosis.Methods30 patients with osteosarcoma were selected from those who were treated in our hospital from 2009 to 2010, and 30 surgical excision specimens were obtained. Patients’ information was obtained, including the gender, age, location of lesions, staging according to the Enneking system, histopathological type, with or without lung metastases and survival of patients in the postoperative follow-up. The imprinting status of H19 gene was determined by the Polymerase Chain Reaction ( PCR ), Reverse Transcription-PCR ( RT-PCR ) and restrictive endonuclease ( AluI ) digestion in 30 patients with osteosarcoma. The loss of imprinting ( LOI ) of H19 gene and its relationship with different clinicopathologic parameters of osteosarcoma were studied.Results( 1 ) The LOI rate of H19 gene was 41.67% in osteosarcoma tissues, 16.67% in adjacent neighboring tissues and 8.33% in distant neighboring tissues. The Kappa results of correlation analysis showed that the occurrence frequencies of LOI of H19 gene among different kinds of tissues stated above were signifcantly correlated ( P＜0.05 ). ( 2 ) One-way analysis of variance ( ANOVA ) revealed that the LOI of H19 gene in osteosarcoma were related with the Ennecking staging and lung metastases or not ( P＜0.05 ). However, it was irrelevant with the gender, age, location, size and pathological type of patients ( P＞0.05 ). ( 3 ) Log-rank univariate survival analysis suggested that the LOI of H19 gene, tumor staging, pathological type and presence of metastases or not were related with the prognosis of patients with osteosarcoma ( P＜0.05 ), but the gender, age or location of lesions were not related with the prognosis ( P＞0.05 ). The survival rate of the patients with the LOI of H19 gene was signifcantly declined, and the differences were statistically signifcant ( P＜0.05 ).ConclusionsThe changes of imprinting status of H19 gene in osteosarcoma mean that it plays an important role in the carcinogenesis,progression, invasion and metastasis of osteosarcoma, and is related with the poor prognosis. It may become the new target to predict the patients’ prognosis.

Gene expression regulation, neoplastic; Osteosarcoma; Prognosis; H19 gene

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.02.014

R738

甘肃省卫生行业科研项目 ( GWGL2010-13 )

730000 兰州，甘肃省第二人民医院骨科

2013-01-30 )