以全燕麦为基质的干酪乳杆菌Zhang固态发酵研究

史 燕，张淑丽，王海宽

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

以全燕麦为基质的干酪乳杆菌Zhang固态发酵研究

史 燕，张淑丽，王海宽

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

以燕麦全粉为唯一基质进行干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) Zhang固态发酵，以期获得一种具有益生元功效的谷物发酵食品．为了提高干酪乳杆菌的活菌数，对燕麦固态培养基进行了优化，选择含水量、接种量、发酵时间和培养基初始pH进行单因素实验，通过正交实验进一步优化得到最佳发酵条件．结果表明：含水量55%、接种量9%、培养基初始pH 6、37,℃静置培养36,h为最佳条件，此时干酪乳杆菌活菌数为6.32×109,,g-1，滴定酸度为9.93,mL，乳酸含量为0.45,g/100,g．对燕麦发酵前后的营养成分进行分析可知，发酵后β–葡聚糖含量为1.61,g/100,g，和发酵前相比几乎没有降低，α–氨基氮的含量增加了0.06,g/100,g，相对分子质量小于6,000的多肽增加了10.62%．

燕麦；干酪乳杆菌；固态发酵；β-葡聚糖；多肽

益生菌具有抑制致病菌和腐败菌、缓解乳糖不耐症、防癌、抗突变、降低血清中胆固醇、预防胃肠道感染、抗腹泻、增强免疫能力等生理功能，近几年来一直备受人们的关注．而传统益生菌产品多为发酵乳制品，但乳中富含脂肪和胆固醇，还可能引发乳糖不耐症，不适合一些消费者长期食用[1]．所以非乳益生菌食品已成为益生菌食品发展的重要趋势[2]．

燕麦是谷物中最好的全价营养食品．它具有含量相对较高的蛋白质、不饱和脂类、维生素、抗氧化物质和酚类，以及不同类型的膳食纤维，例如，β–葡聚糖、阿拉伯木聚糖和纤维素[3-4]．其中可溶性膳食纤维β–葡聚糖是主要的功能成分，具有降低血液中胆固醇的含量以及餐后血糖水平的作用[5]．同时，肠道微生物发酵β–葡聚糖(作为一种益生元)后会形成短链脂肪酸，从而保护结肠膜[6]．研究已经证明，燕麦适用于益生菌发酵，且在发酵的过程中会产生一些易于人体机体吸收的有益成分．Loponen等[7]在燕麦发酵的过程检测了燕麦球蛋白可溶性以及水解性的

变化，表明在燕麦发酵中蛋白作为燕麦的结构成分可以被水解而提供具有香味和活性肽的产物. 葛磊等[8]用中温α–淀粉酶、糖化酶对燕麦进行双酶水解，得到的糖化液配以脱脂奶粉，进行杀菌，冷却后再以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为发酵剂进行接种发酵，制备出一种含有活性成分且具有保健功能的生物乳饮料．Angelov等[9]利用乳酸菌发酵全粒燕麦获得了一种含有β–葡聚糖益生功效的饮料．

目前，市场上以燕麦为主要原料的益生菌产品较多，但多添加各种糖类，不适宜高血脂、高血糖等人群长期食用，而以燕麦全粉作为益生菌唯一载体的固态发酵产品国内外仍未见报道．同时，固态发酵较液态发酵具有工艺简单、无污染、成本低、易推广、对环境和设备要求低的优势．干酪乳杆菌Zhang是分离自内蒙古地区传统酸马奶中的一株益生菌．该菌株的耐酸性、人工胃肠液和胆盐耐受性良好[10]，并且，大量的实验研究表明其具有显著的降血脂和免疫调节作用[11-12]．因此，本研究旨在以燕麦全粉为唯一基质进行干酪乳杆菌Zhang固态发酵特性的研究，以期获得一种具有益生元功效的谷物发酵食品．

1 材料与方法

1.1 原料、菌种及试剂

燕麦，市售，捣碎机捣碎成粉末，过20目筛．

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang，内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室．

蛋白胨、牛肉膏均为生化试剂；Tween 80为化学纯；葡萄糖、柠檬酸三铵、乙酸钠、K2HPO4、MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O等均为分析纯试剂．

1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨10,g，牛肉膏10,g，酵母膏5,g，K2HPO42,g，柠檬酸三铵2,g，乙酸钠2,g，葡萄糖20,g，MgSO4·7H2O 0.5,g，MnSO4·4H2O 0.25,g，Tween,80 1,mL，蒸馏水1,L，pH 6.5，115,℃灭菌20,min．

计数培养基：MRS固体培养基．

燕麦固态发酵培养基：向燕麦粉中加入一定量的水，然后用玻璃棒搅拌均匀，配制成初始含水量不同的燕麦培养基，115,℃灭菌20,min．

1.3 菌种的活化

取少量保存于甘油管内的干酪乳杆菌Zhang于 MRS琼脂平板上划线，挑取单菌落用MRS固体斜面培养基进行菌种活化传代，从活化的MRS固体斜面培养基上挑取适量菌体接入MRS液体培养基中，37,℃静置培养20,h，然后将活化的菌液按V(菌液)/V(培养基)＝5%的接种量接入MRS液体培养基中，37,℃静置培养16,h，制成种子液．

1.4 实验方法

1.4.1 含水量对干酪乳杆菌活菌数的影响

对不同初始含水量(m(水)/m(培养基)＝50%、55%、60%、65%)进行单因素实验，接种量为8%，37,℃静置培养24,h后，分别对以上固态发酵培养体系进行干酪乳杆菌活菌计数，每组处理重复3次．

1.4.2 接种量对干酪乳杆菌活菌数的影响

在上述确定的含水量的基础上，其他条件不变，对不同接种量(m(菌液)/m(培养基)＝5%、8%、10%、11%)进行单因素实验，分别对以上固态发酵培养体系进行干酪乳杆菌活菌计数，每组处理重复3次．

1.4.3 发酵时间对干酪乳杆菌活菌数的影响

在上述确定的固态发酵培养条件的基础上，其他条件不变，对培养时间(12、24、36、48,h)进行单因素实验，分别对以上固态发酵培养体系进行干酪乳杆菌活菌计数，每组处理重复3次．

1.4.4 培养基初始pH对植物乳杆菌活菌数的影响

在上述确定的固态发酵培养条件的基础上，其他条件不变，对培养基初始pH(5.5、6.0、6.5、7.0)进行单因素实验，分别对以上固态发酵培养体系进行干酪乳杆菌活菌计数，每组处理重复3次．

1.4.5 干酪乳杆菌固态发酵燕麦优化正交实验

在上述单因素实验的基础上，选择各因素的3个最佳水平设计正交实验．

1.5 检测方法

1.5.1 干酪乳杆菌Zhang活菌检测

称取10,g燕麦固体发酵样品置于装有90,mL无菌生理盐水的匀浆杯中，匀浆15,s，制成1∶10的样品匀液．然后梯度稀释，选择合适稀释度按国家标准GB 4789.35—2010进行活菌计数[13]．

1.5.2 pH和总酸度(TTA)的测定

根据AACC(2000)02-52方法[14]，称取10,g燕麦固态发酵产物，放入锥形瓶中，加入90,mL无CO2的蒸馏水，用磁力器搅拌30,min，静置10,min后用pH计测定新鲜曲料的pH；并用0.1,mol/L NaOH溶液滴定，用pH计测定滴定终点pH 8.6．所需0.1,mol/L NaOH溶液的体积(单位为mL)即为总酸度．重复3次取平均值.

1.5.3 固态发酵前后成分含量的测定

可溶性膳食纤维含量的测定按照AACC32-07方法[15]；β–葡聚糖含量的检测按照AOAC995.16方法[16]；α–氨基氮的测定采用茚三酮显色法[17]；乳酸含量利用生物传感仪进行测定．

1.6 燕麦多肽样品的制备

取燕麦发酵样品10,g，匀浆器破碎后，将所得发酵物用5倍无菌生理盐水在4,℃浸提4,h，在4,500,r/min条件下离心取上清液，冷冻干燥后取粉末2.0,g，加水50,mL充分溶解，3,000,r/min离心15,min，取上清液，经0.45,µm微孔滤膜过滤．另有未接种固态发酵物作为空白对照．

1.7 多肽相对分子质量分布的测定[18]

色谱条件：色谱柱为GE SuperdexTMPeptide 10/300GL(10,mm×300,mm)凝胶柱；流动相为50,mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH,7.2，含0.15,mol/L NaCl)；柱压小于1.8,MPa；流量0.7,mL/min；检测波长214,nm；柱温为室温；进样量10,μL．以细胞色素C(Mr＝12,500)、抑肽酶(Mr＝6,512)、氧化性谷胱甘肽(Mr＝615)、还原谷胱甘肽(Mr＝310)、甘氨酸(Mr＝75)为相对分子质量标准品．

2 结果与讨论

2.1 干酪乳杆菌固态发酵燕麦培养条件的优化

2.1.1 含水量对干酪乳杆菌活菌数的影响

初始含水量对干酪乳杆菌Zhang固态发酵燕麦活菌数的影响见图1．

由图1可知，含水量达到55%时，干酪乳杆菌Zhang活菌数最高，为3.24×109g-1．

2.1.2 接种量对干酪乳杆菌活菌数的影响

接种量对干酪乳杆菌Zhang固态发酵燕麦活菌数的影响见图2．

由图2可知：接种量从5%增大到10%，干酪乳杆菌Zhang活菌数随之递增；当接种量为10%时，活菌数最高，为4.13×109g-1．

2.1.3 发酵时间对干酪乳杆菌活菌数的影响

不同发酵时间的实验结果见图3．

由图3可知：在一定范围内，干酪乳杆菌Zhang活菌数随着发酵时间的延长而递增；当发酵时间为36,h时，活菌数最高，为6.17×109,g-1．

2.1.4 培养基初始pH对干酪乳杆菌活菌数的影响

不同初始pH的实验结果见图4．

由图4可知，培养基初始pH对干酪乳杆菌Zhang活菌数有一定的影响，当pH为6.0或6.5时，活菌数分别为6.17×109g-1和6.18×109g-1，差别不明显，但比pH为5.5和7.0的活菌数都高．

2.2 正交实验确定最佳培养条件

在上述单因素实验的基础上，选择各因素的3个最佳水平设计正交实验，结果见表1．

由表1可知：对干酪乳杆菌Zhang活菌数影响的主次顺序是发酵时间＞含水量＞pH＞接种量；理论最佳组合为：含水量55%、接种量9%、发酵时间36,h、培养基初始pH,6．

在此优化条件下培养干酪乳杆菌Zhang，经验证，其活菌数为(6.32±0.14)×109,g-1，相比于未优化前的活菌数有所提高，也高于正交实验中的各个组合条件下的活菌数．

2.3 发酵过程中pH和总酸度变化

发酵过程中pH和总酸度变化见图5．

由图5可以看出：在最初的0～4,h的发酵过程中，随着发酵时间的延长，燕麦培养基的pH由原来的5.67迅速下降到4.75左右；4,h以后，pH只是轻微的变化；当32,h以后，pH为4.13并保持不变．总酸度随着发酵时间的延长而增加，这是由于干酪乳杆菌Zhang产酸，酸不断积累导致酸度上升，当发酵到36,h时，总酸度达到9.93,mL．

2.4 发酵前后燕麦成分的变化

将优化后得到的燕麦固态发酵产物进行成分变化分析，结果见表2、表3．

由表2可知：可溶性膳食纤维由发酵前的2.19,g/ 100,g变为2.08,g/100,g，变化不显著；大部分的β–葡聚糖属于可溶性膳食纤维，其含量由发酵前1.63,g/100,g变为1.61,g/100,g，几乎没有降低，这可能是由于干酪乳杆菌对β–葡聚糖降解能力差造成的；α–氨基氮的含量由0.11,g/100,g上升至0.17,g/100,g，同时，产生的乳酸量为0.45,g/100,g．β–葡聚糖能够降低血糖、降低血脂，具有极好的保健作用．燕麦中β–葡聚糖含量居于谷物之首，故固态发酵完的燕麦产品仍具有降血糖和降血脂的保健作用．

将色谱数据用GPC数据处理软件进行计算，即可得到样品中多肽的相对分子质量分布范围(表3)．从表3中可以看出：在干酪乳杆菌固态发酵燕麦36,h后，与空白对照组作比较，相对分子质量大于10,000的多肽(蛋白质)含量降低了56.33%，相对分子质量小于6,000的多肽增加了10.62%，其中，相对分子质量在3,000～6,000的多肽含量增加了3.29%，相对分子质量在1,000～3,000的多肽含量增加了

36.85%，相对分子质量小于1,000的小分子肽含量增加了6.36%．而生物活性肽(BAP)指的正是一类相对分子质量小于6,000的多肽，其在体内吸收快，利用率高，并且营养丰富，具有抗高血压，抗血栓形成、降血糖、抗癌、抗衰老、防止肝硬化等多种功能[19]. 实验表明，干酪乳杆菌Zhang发酵燕麦的过程中菌体会分泌蛋白酶，可使蛋白质水解产生小分子的肽类和氨基酸，有利于人体更好地吸收．

3 结 论

本实验选取了可能影响干酪乳杆菌Zhang固态发酵燕麦活菌数的含水量、接种量、发酵时间以及培养基的初始pH进行单因素和正交优化实验，得到了最优发酵条件：含水量55%、接种量9%、发酵时间36,h、培养基初始pH 6，在此条件利用燕麦为唯一基质进行发酵所得干酪乳杆菌Zhang活菌数为6.32× 109,g-1，总酸度为9.93,mL．

对比发酵前后燕麦基质成分的变化，作为可溶性膳食纤维的主要成分的β–葡聚糖含量几乎没有降低；乳酸含量为0.45,g/100,g；α–氨基氮的含量增加了0.06,g/100,g；相对分子质量小于6,000的多肽增加了10.62%．

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责任编辑：常涛

Whole Oat Solid-state Fermentation with Lactobacillus casei Zhang

SHI Yan，ZHANG Shuli，WANG Haikuan
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

In this study，the whole oat powder was used as the only medium for the solid-state fermentation with Lactobacillus casei Zhang for the purpose of developing a fermented grain food with prebiotic effect. In order to obtain the high viable count of L. casei Zhang，the optimal fermentation conditions were obtained through single factor tests and the orthogonal tests of the moisture content，inoculum size，fermentation time and the initial pH of the medium. In the optimal conditions(moisture content 55%，inoculum size 9%，pH 6，fermentation 36,h and under 37,℃)，the highest population was 6.32× 109,g-1，the titratable acidity was 9.93,mL and the amount of lactic acid was 0.45,g/100,g. By analyzing the nutrition compositions of the oat before and after fermentation，the following conclusions could be made. Almost no change was seen in the β-glucan content，which was 1.61,g/100,g after fermentation；the content of α-ammonia nitrogen and peptide whose relative molecular weight is less than 6,000,increased by 0.06,g/100,g and 10.62%，respectively.

oat；Lactobacillus caseiZhang；solid-state fermentation；β-glucan；peptide

TS213.2

A

1672-6510(2014)06-0016-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.004

2014–03–29；

2014–06–11

国家自然科学基金资助项目(30900961)

史 燕（1986—），女，河北人，硕士研究生；通信作者：王海宽，教授，hkwang@aliyun.com.