孕妇外周血胎儿ε血红蛋白基因mRNA的表达及与孕龄的相关性

刘红英，杨利丽，杨和军，刘顺梅，张金宝

近年来，随着人们对于遗传疾病危害的认识逐渐加深，产前诊断越来越受到关注。由于传统产前诊断方法对于孕妇及胎儿均存在一定的伤害，因此，无创性产前诊断成为近年来众多学者的研究热点之一[1]。母血中胎儿特异性RNA的发现为无创性产前诊断的研究开辟了新的篇章[2]。本研究通过对孕妇外周血胎儿ε血红蛋白基因mRNA的定量分析，阐述ε血红蛋白基因mRNA的浓度与孕龄之间的关系，从而为进一步临床诊断方案的选择提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年10月—2009年11月在潍坊市人民医院行产前检查的7～16周正常单胎妊娠孕妇30例为研究对象，年龄25～37岁；第一次妊娠9例，多次妊娠21例。均无内外科疾病和吸烟史，均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理 取孕妇空腹肘静脉血5 ml，置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝的试管中，5 ml全血加入10 ml 异硫氰酸胍裂解液，快速而彻底的匀浆，并分装到1.5 ml的离心管中，每管装1 ml全血异硫氰酸胍裂解液。

1.2.2 全血RNA的提取和检测 常规方法提取孕妇全血RNA，紫外分光光度计检测吸光度，判断RNA的浓度和纯度是否符合要求。

1.2.3 胎儿ε血红蛋白基因mRNA表达水平检测 使用AMV逆转录试剂盒进行cDNA的合成，总反应体系20 μl，其中RNA 5 μl，5倍反应缓冲液4 μl，Rnase inhibitor(20 U/μl) 1 μl，dNTP mix(10 mmol/L) 2 μl，AMV逆转录酶(10 U/L) 2 μl，逆转录结束后产物于-70 ℃冷冻保存备用。

PCR扩增胎儿血红蛋白ε基因，上游引物5′-TTTTACTGCTGAGGAGAAGGCTGCC-3′，下游引物5′-CTTGCCAAAGTGAGTAGCCAGAATAA-3′。以GAPDH基因作为内参，引物如下：上游引物5′-TGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物5′-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′。PCR循环周期条件：变性94 ℃ 60 s，退火57 ℃ 120 s，延伸72 ℃ 120 s，共35个循环，然后72 ℃ 延伸 8 min，于 4 ℃ 条件下终止反应。

1.2.4 对胎儿血红蛋白基因ε序列扩增产物的定量分析 利用凝胶成像系统对血红蛋白基因ε序列扩增产物阳性样品进行琼脂糖凝胶电泳，利用ImageJ软件对每条电泳条带进行图像分析，测定电泳条带的灰度值。计算孕妇外周血中ε血红蛋白基因mRNA 的浓度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，采用Spearman秩相关分析研究外周血中ε血红蛋白基因mRNA浓度与孕龄之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇外周血总RNA的质量浓度及纯度测定 30例样品RNA质量浓度值为0.98～3.19 g/L，平均(1.87±0.76)g/L；光密度平均比值为1.79，所提全血总RNA具有较高的质量浓度及纯度(见图1)。

2.2 胎儿ε血红蛋白基因mRNA的体外扩增结果 样品的凝胶电泳图像见图2，30例样品中，7例阳性，23例阴性。根据电泳条带灰度值，计算血红蛋白基因ε序列mRNA的表达浓度(见表1)。孕妇外周血中胎儿ε血红蛋白基因mRNA 浓度为0.537～1.790 μg/ml，中位数为1.241 μg/ml。孕妇外周血中胎儿ε血红蛋白基因mRNA的浓度与孕龄呈负相关(r=-0.750，P=0.026，见图3)。

注：泳道1～5均为孕妇外周血RNA样本

图1 血液总RNA电泳条带

Figure1 Electrophoresis result of whole-RNA extracted from maternal blood

注：泳道1为DNA marker(100～1 000 bp)，泳道2～6为ε血红蛋白基因mRNA RT-PCR产物，长度为355 bp，泳道7为GAPDH mRNA 标准品RT-PCR产物，长度为222 bp，泳道8为空白对照

图2 胎儿ε血红蛋白基因mRNA RT-PCR电泳图

Figure2 Electrophoresis result of ε hemoglobin gene mRNA after RT-PCR

3 讨论

图3 孕妇外周血中ε血红蛋白基因mRNA的浓度与孕龄的相关性

Figure3 The concentration of ε hemoglobin gene mRNA in different pregnant woman′s blood

表1 胎儿ε血红蛋白基因mRNA凝胶成像结果

无创性产前诊断一直是近几年来医学工作者的研究重点之一，母血中胎儿遗传物质的识别和收集正是这项研究的靶点[3]。研究报道发现人们已经陆续从母血中分离到了胎儿的有核红细胞[4]和胎儿DNA[5]，为无创性产前诊断的实施奠定了基础。但由于有核红细胞和胎儿DNA存在分离困难、庞大母体背景影响等缺点[6]，因此，母血中胎儿RNA的分离应用备受关注。本研究着重探讨了从母血中分离收集胎儿ε血红蛋白基因mRNA的方法，并分析了其表达水平与孕龄的关系，为临床无创性产前诊断的具体实施提供了理论依据。

在胚胎发育早期，胎儿体内的血红蛋白主要有Hb Gower1(ζ2ε 2)和Hb Gower2(α2ε2)两种类型；到胚胎发育第8周后，则以HbF(α2γ2)为主；出生后至成人期则以HbA(α2β2)为主[7]。从上述血红蛋白出现的不同时间及其不同的分子式可以看出，血红蛋白的各种基因表达时间和表达丰度会随着胚胎的发育不断的发生变化。因此，本研究选择孕7～16周的早孕妇女为研究对象，从母血中分离胎儿ε血红蛋白基因mRNA，并探讨其与孕龄的关系。结果发现，孕妇外周血中确实存在胎儿ε血红蛋白基因mRNA，而且其含量在孕7～10周与孕龄呈负相关。此结果与国内外学者研究基本一致[8]。

本研究选择的30例标本中只有7 例阳性，其余23 例均为阴性，分析原因发现，23 例阴性者大都为10～16周的孕妇，故提示在临床应用母血中胎儿ε血红蛋白基因mRNA做产前诊断时，应选择在孕7～10周进行，且由于其含量与孕龄呈负相关，因此越早越好。

综上所述，与胎儿有核红细胞和胎儿DNA相比，胎儿mRNA具有分离容易、不受母体背景影响等优点，因此胎儿mRNA用于无创性产前诊断具有切实的可行性，虽然存在含量微少等实际缺陷[9]，但仍为临床诊断方案的具体实施提供了广阔的前景。

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7 张俊武，龙桂芳.血红蛋白与血红蛋白病[M].南宁：广西科学技术出版社，2003：32-34.

8 Lam KW,Jiang P,Liao GJ,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by targeted massively parallel sequencing of maternal plasma:application to β-thalassemia[J].Clin Chem，2012,58(10):1467-1475.

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