雷公藤甲素治疗胰腺癌分子机制的生物信息学分析❋

车玉梅，何小鹃, 李 立，徐 洁，王敏智，吕爱平，马超英

(1.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031；2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700)

胰腺癌(Pancreatic cancer，PC)致死率位居恶性肿瘤第四位，其平均存活期只有5～6个月，5年生存率不足6%[1]，目前临床一线化疗药物吉西他滨或其与顺铂、奥沙利铂、5-氟、卡培他滨、伊立替康、多烯紫杉醇联合用药，均无法有效延长患者的生存期(仅有6～10个月)[2]。肿瘤耐药[3]和癌细胞转移[4]是导致胰腺癌临床化疗失败的主要原因。TP(Triptolide, TP)是传统中草药雷公藤的主要活性成分，研究表明TP是一种广谱抗癌药，具有多重抗癌机制，其抗癌活性比传统抗癌药物紫杉醇、多柔比星、丝裂霉素、顺铂更强[5]。体外研究显示，TP能够有效诱导胰腺癌细胞凋亡，抑制肿瘤血管形成和癌细胞转移[6, 7]。体内研究表明，TP可有效减少小鼠体内胰腺癌细胞，是非常有潜力的抗胰腺癌候选药[8]。为探讨TP治疗胰腺癌的作用机制，我们尝试运用生物信息学方法分析二者的分子网络、生物学经典通路和作用位点，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 靶蛋白及相关基因的检索

在PubChem(http:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查找TP(Triptolide)的分子信息及相应的生物学测试，进而确定该化合物的活性靶蛋白。以“Pancreatic Cancer”为关键词，在Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库中查找胰腺癌的相关基因。

1.2 构建TP及胰腺癌的分子网络

将检索到的TP对应靶蛋白及胰腺癌相关基因，在线提交至IPA(Ingenuity Pathway Analysis http://www.ingenuity.com/)生物分析软件。利用IPA软件中的网络分析(Network analysis)功能，分别构建TP靶蛋白及胰腺癌相关基因的分子网络。

1.3 对比TP靶蛋白及胰腺癌相关基因共同作用的生物学通路及作用位点

利用IPA软件中比较(Comparison)模块，比较TP对应的靶蛋白及胰腺癌的生物学通路，并选取二者共同作用的通路进行深入研究，分析二者在共同作用的生物学通路中的位点，明确TP治疗胰腺癌的分子机制。

2 结果

2.1 TP的靶蛋白及胰腺癌相关基因

截止2013年9月26日，在PubChem数据库中查到TP的靶蛋白共11个，在Gene数据库中查到胰腺癌相关基因288个，随后将这些分子上传至IPA软件。

2.2 TP靶蛋白及胰腺癌相关基因的分子网络

将检索到的TP靶蛋白及胰腺癌相关基因上传至IPA软件，利用网络分析功能构建二者的分子网络，其中雷公藤靶蛋白共构建2个功能不同的网络，胰腺癌相关基因共构建23个功能不同的网络(选择前3个进行展示)(表1A、B)。网络图中，每个节点代表1个分子，图中灰色的分子为TP的靶蛋白或胰腺癌相关基因，未涂色的分子为构建网络所需的相关分子。图注说明不同形状分子的分类属性，实线代表2个分子间直接的作用关系，虚线代表2个分子间接的作用关系。

表1 TP靶蛋白及胰腺癌相关基因构成的分子网络图及网络功能

ATP靶蛋白(灰色分子)构成的分子网络及功能

B胰腺癌靶蛋白(灰色分子)构成的分子网络图

从二者构成的分子网络图中我们可以看出，构成TP靶蛋白网络的分子，大多与细胞信号传导和相互作用、神经系统疾病、细胞发育以及凋亡有关；胰腺癌相关基因网络中的分子，大多与细胞周期、细胞发育、细胞生长和增殖以及凋亡有关，说明二者构成的网络既有共同的分子又有差异的分子，各自的生物功能复杂多样。

2.3 生物学通路比较

通过IPA软件的Comparison Analysis模块，对比TP靶蛋白和胰腺癌相关基因作用的生物学通路，我们发现二者共同作用的通路超过20条，对其通路进行分类，其中2类通路与癌症相关，分别为凋亡相关通路(图2)、癌症信号相关通路(图3)。在凋亡相关通路中，主要涉及神经酰胺信号通路、IL-15生成通路、IL-15信号通路及JAK/Stat信号通路；癌症信号相关通路主要涉及胰腺癌信号通路、组织因子调控通路、PI3K/AKT信号通路、结肠癌转移信号通路、肿瘤分子调控5个信号通路。以上结果提示，TP主要作用于凋亡通路和癌症信号通路，且通过调节这些通路进而对胰腺癌产生疗效。

图2 TP靶蛋白及胰腺癌相关基因共同作用的凋亡通路

图3 TP靶蛋白及胰腺癌相关基因共同作用的癌症信号通路

2.4 生物通路作用位点

为明确TP靶蛋白及胰腺癌相关基因参与以上共同通路的作用位点，基于以上结果我们选取了神经酰胺信号通路、胰腺癌信号通路、PI3K/AKT信号通路、抑瘤素M信号通路进行深入分析(见图4A、B、C、D)。图中涂灰分子为胰腺癌在通路的作用位点，粗边分子为TP在通路的作用位点。可以发现，粗边且涂灰标记的JAK为TP参与胰腺癌的癌症相关通路作用位点。

图4 TP靶蛋白及胰腺癌相关基因共同作用的生物学通路作用位点

3 讨论

中医认为胰腺癌多为实证，其常见证型为气滞血瘀证、湿热蕴结/湿热毒蕴证、脾虚湿热/湿困、阴虚(含阴虚内热、气阴两虚)，多认为病位在脾(脾胃)，其次为肝(肝胆)[9]。雷公藤为卫矛科植物，传统中医认为其归属于祛风湿药，有祛风除湿之功效[10]。TP是雷公藤的主要药效成分，是环氧化二萜内酯化合物，具有广泛、强效的药理作用：具有广谱、强效的抗肿瘤活性，对来源于白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌等诸多癌症细胞有强效的杀伤作用；TP可抑制促炎因子和趋化因子的产生，其抗炎作用已经在多种细胞模型和动物模型中被证实；可通过直接抑制基质金属蛋白酶的产生并持续上调IL-1治疗滑膜成纤维细胞中抑制水平，治疗类风湿关节炎等自身免疫疾病。已有研究表明，TP通过凋亡途径(死亡受体途径和线粒体途径)和自噬途径引起胰腺癌细胞程序性死亡[6]，此外TP可显著抑制小鼠体内胰腺癌细胞生长和转移[11]。目前，对TP治疗胰腺癌的深入研究正在开展。

Pubchem是由NIH(美国国立卫生研究院)运行的小分子生物活性综合数据库，其中包含众多对化学物质的活性测定数据。国内已有学者利用该数据库进行研究，同时结合生物信息学技术，利用IPA软件将疾病相关基因与化合物的活性靶标进行网络拟合与交互，可以探索化合物对疾病治疗的潜在靶点，国内外已有相关研究发表[12, 13]。

本研究结果显示，TP的靶蛋白和胰腺癌相关基因构成的网络、分子之间相互联系与作用，生物功能复杂。在胰腺癌的发病过程中，溶血磷脂酸及其对应GPCR-EDG可以诱发细胞功能改变，如诱导细胞分化、存活、抗药和运动能力[14]。而JAK (加纳斯激酶)作为重要的信号传导分子，在癌症和自身免疫性疾病中的研究得到更多重视[15, 16]。本研究提示，TP可能通过凋亡相关的神经酰胺途径，通过影响EDG继而激活Ras基因，从而诱导细胞凋亡[17]。同时，TP还可能通过作用于JAK，进而干预胰腺癌信号通路和抑瘤素M通路上的STAT3和STAT1跨核膜作用，对核内胰腺癌相关的细胞周期调控以及基质金属蛋白酶相关基因的表达进行影响[15, 18, 19]。与此同时，TP也可通过作用JAK，在胞浆内干预akt基因，进而调控众多的下游基因[20]。上述结果表明，JAK和EDG可能是TP治疗胰腺癌的作用靶点，而其具体作用强度和作用机制还有待进一步深入研究。

基于Pubchem数据库和IPA生物信息学分析，可以探索TP治疗胰腺癌的分子机制，为后续的深入验证研究提供较好的思路和明确的靶点，是一个良好的尝试和开端。若在此基础上开展更广泛和深入的基础研究，进而明确揭示TP治疗胰腺癌的作用机理，必将为TP的临床应用打下更为坚实的基础。

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