微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定

颜佳铖，纪晓俊，聂志奎，邓中涛，任路静，黄 和

(南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009)

微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定

颜佳铖，纪晓俊，聂志奎，邓中涛，任路静，黄 和

(南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009)

建立了快速、准确测定微生物油脂中花生四烯酸(ARA)含量的气相色谱检测方法。选用DB-23毛细管色谱柱，设置合适的载气压力，采用FID检测器，对ARA含量进行了定量分析。测定结果表明：油脂中各脂肪酸组分可有效分离，分析时间仅需20 min，ARA的回收率为90.146%～100.634%，相对标准偏差为4.175%。

ARA；气相色谱分析；微生物油脂

花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称ARA)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸。作为人体必需的多不饱和脂肪酸，是前列腺素(prostaglandin)、凝血恶烷(thromboxane)和白三烯(leucotriene)等类二十烷酸的前体物质[1-4]。ARA具有多种生理活性，在医药、食品和化妆品等领域都有广泛的应用[5]。

ARA普遍存在于陆地动物的油脂中，但含量不高，无法满足日益增长的需求，采用微生物发酵是获取ARA的方式之一[6]。目前，ARA分析检测技术主要有甲酯化气相色谱法[7]、高效液相色谱法[8]、薄层色谱法[9]及柱层析[10]等。其中应用最为广泛的是气相色谱法。

脂肪酸含量的测定多采用面积归一化法，但该法将各脂肪酸的校正因子视为相等，不能正确反映细胞内ARA含量。而外标法需要进样量精确，对进样技术要求较高。采用内标法可克服上述方法的缺陷，内标物选择待测物中不含的脂肪酸，如奇数碳脂肪酸(C13∶0，C17∶0等)[11-12]。笔者采用内标法，以十三烷酸甲酯(C13∶0甲酯)为内标，DB-23为分离柱，建立测定微生物油脂中ARA含量的方法，以期实现ARA含量的快速准确测定，满足工业化生产的要求。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器设备

1.1.1 实验原料

材料：微生物油脂，取高山被孢霉发酵中期提取的油脂。

标准试剂：ARA甲酯100 mg(纯度99%)，ARA 甘油三酯100 mg(纯度99%)，十三烷酸甲酯1 000 mg(纯度97%)，均为色谱纯试剂，购自Sigma公司。

试剂：0.5 mol/L KOH-CH3OH分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；BF3-乙醚-甲醇溶液(V(BF3-乙醚)∶V(甲醇)=3∶7)分析纯，其中BF3-乙醚购自江苏永华精细化学品有限公司；NaCl分析纯，购自西陇化工股份有限公司；正己烷色谱纯，购自山东禹王实业有限公司。

1.1.2 仪器设备

在岛津GC-2010气相色谱仪上，用DB-23(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱进行分析，载气为高纯度N2，柱流1.56 mL/min，尾吹流速30 mL/min，H2流速30 mL/min，空气流速400 mL/min，分流比为30∶1。

汽化室温度为250 ℃，检测器温度为280 ℃，色谱柱初始温度为100 ℃，以25 ℃/min升至196 ℃，再以2 ℃/min升至220 ℃，保持 6 min。进样量为1 μL；其中毛细管柱购自安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

ARA甲酯储备液的配制：取10 mL容量瓶，正己烷洗数次。称取ARA 甲酯48.2 mg，用正己烷溶解后转移至上述容量瓶中，定容、摇匀，得到ARA甲酯储备液的质量浓度为4.78 mg/mL。

C13∶0甲酯溶液的配制：取25 mL容量瓶，正己烷冲洗数次。称取内标物C13∶0甲酯56.2 mg，正己烷溶解后转移至该容量瓶中，定容、摇匀，所得内标物的质量浓度为2.18 mg/mL。

标准工作溶液的配制：按下表分别移取适量ARA甲酯储备液于4个5 mL容量瓶中，加入正己烷稀释至刻度，摇匀。连同ARA甲酯储备液，可得到5种浓度的ARA甲酯溶液。

将上述溶液分装于2 mL气相进样瓶中，封口胶密封，做好标记，备用。

表1 标准工作液中ARA甲酯的含量Table 1 Content of ARA methyl esters in standard solution

1.2.2 试样的制备

准确称取油脂试样0.45～0.55 g，添加正己烷定容至10 mL，振荡使其完全溶解后，取1 mL溶液于10 mL容量瓶中，加0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液3 mL，振荡，65 ℃水浴15 min，冷却至室温后加入BF3-乙醚-甲醇溶液3 mL，振荡，65 ℃水浴5 min。再次冷却至室温，加饱和NaCl溶液2 mL及正己烷1 mL，多次萃取上清，正己烷定容至10 mL容量瓶中，用于气相色谱分析。

1.3 测定方法

采用内标法进行定量测定，内标物为C13∶0甲酯，200 μL待测试样和200 μL内标品充分混合，用于气相色谱分析。

微生物油脂中脂肪酸含量可换算为该脂肪酸占总油质量的百分比，计算见式(1)。

2 结果与讨论

2.1 内标物与待测物的定性分析

将C13∶0甲酯和ARA甲酯分别进行GC分析，得到二者的气相色谱图如图1和图2所示。

图1 内标物C13∶0甲酯的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of C13∶0 methyl ester

图2 ARA甲酯的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of ARA methyl ester

由以上2种纯物质的气相色谱图，可分别得到C13∶0甲酯和ARA甲酯的保留时间，其中内标物C13∶0甲酯的保留时间为7.555 min，ARA甲酯的保留时间为17.768 min。

2.2 ARA的定量分析

添加内标物的气相色谱分离检测图如图3所示。由图3可知：2种脂肪酸分离效果良好，其他组分不干扰测定。

图3 添加内标物的气相色谱图Fig.3 Gas chromatogram of fatty acids in microbial oils with internal-standard

2.2.1 相对校正因子的测定

分别取相同浓度的内标物C13∶0甲酯和不同质量浓度的ARA甲酯各200 μL，其中C13∶0甲酯的质量浓度为2.18 mg/mL，ARA甲酯的质量浓度分别为4.78、2.39、1.20、0.48和0.24 mg/mL，混合均匀，每个试样进样2次，取平均值，测定结果见表2。

表2 测定ARA甲酯相对C13∶0甲酯的相对校正因子Table 2 Determination of relative calibration factors of ARA methyl ester to C13∶0 methyl ester

注：该组数据的相对标准偏差是4.306 6%。

2.2.2 方法精确度的测定

取同一批油脂，精确称取5份试样，按1.2.2方法进行试样预处理后，按1.3方法进行定量分析，进样2次，取平均值，精确度分析结果见表3。

表3 微生物油脂试样中ARA的精确度分析Table 3 Precision of method for detection of ARA in microorganism oil

注：该组数据的相对标准偏差为4.180%。

由表3可知：微生物油脂中ARA的平均质量分数为274.026 mg/g，相对标准偏差为4.180%。实验中由于试样处理过程较复杂、采用手动进样、仪器自身也存在误差，导致数据存在误差，但RSD值小于5%，表明此方法精确度较高，重现性好[13]。

2.2.3 回收率的测定

采用加标回收法，准确称取已知ARA含量的油脂试样5份，分别添加ARA甘油三酯标准品进行回收率实验。按1.2.2方法进行试样预处理后，按1.3定量分析方法进行测定，回收率分析结果见表4。

由表4可知：ARA的回收率为90.146%～100.634%，相对标准偏差为4.175%，由于本方法前期处理过程相对比较复杂，回收率需要满足90%～110%范围，由此可见本组数据满足该方法的要求。

表4 微生物油脂中ARA的回收率Table 4 Recoveries of ARA in microorganism oil

注：该组数据的相对标准偏差是4.175%。

3 结 论

本实验ARA的回收率为90.146%～100.634%，相对标准偏差为4.175%，微生物发酵中期油脂中ARA的含量为274.026 mg/g，相对标准偏差为4.180%，表明此方法的精确度高，可快速、准确地检测微生物油脂中ARA含量，具有检测时间短、精确度高、可靠性好的优点。因此为微生物油脂中脂肪酸的检测提供了一个较为可行的分析方法，具有较高的实用性，并为发酵过程监测和菌种诱变筛选提供了参考标准。

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(责任编辑 周晓薇)

Fast determination of arachidonic acid in microbial oils

YAN Jiacheng,JI Xiaojun,NIE Zhikui,DENG Zhongtao,REN Lujing,HUANG He

(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China)

Gas chromatography was performed for the determination of arachidonic acid (ARA) produced by micro-organisms.Capillary column DB-23 was used with FID and suitable carrier gas for the detection.The result indicated that the method could separate fatty acids well in 20 min on good precision and recovery.The recovery rate of ARA was 90.146% to 100.634%,and the relative standard deviation was 4.175%.Thus,the method was effective for the detection of ARA produced by micro-organisms.

arachidonic acid;gas chromatography;microbial oils

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.013

2012-06-05

国家高技术研究发展计划(863计划)(2014AA021703);国家自然科学基金(21376002)；江苏省自然科学基金(BK20131405)；江苏高校优势学科建设工程

颜佳铖(1988—)，女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向：生物化工；纪晓俊(联系人)，副教授，E-mail:xiaojunji@njtech.edu.cn

Q815

A

1672-3678(2014)02-0066-04