木聚糖酶发酵工艺在50 L罐中的放大

陆 彬，万红贵

(1.江苏同凯兆丰生物科技有限公司南京,211800；2.南京工业大学江苏省工业生物技术创新中心南京,211800)

木聚糖酶发酵工艺在50 L罐中的放大

陆 彬1，万红贵2

(1.江苏同凯兆丰生物科技有限公司南京,211800；2.南京工业大学江苏省工业生物技术创新中心南京,211800)

自制的酵母水解液成功替代有机N源酵母浸膏被应用于木聚糖酶发酵，大大降低了原料成本。在此基础上，于50 L罐中进行发酵工艺放大，得到最佳发酵条件：搅拌转速220 r/min、空气流量23 L/min、初始pH 5.5、温度30 ℃、罐压0.04 MPa，最终发现产酶水平可达到2 864 U/mL，用箭叶圆盘涡轮搅拌桨代替上层平叶圆盘涡轮搅拌桨，产酶水平无显著变化，搅拌功率节约11%。

发酵；毕赤酵母；放大；木聚糖酶

木聚糖酶是将木聚糖分解成低聚糖和木糖的酶系，被广泛应用于造纸、纺织、饲料、食品和医药等行业[1-4]。生产木聚糖酶的微生物有很多，如曲霉属、木酶属和链酶属等，随着基因工程的发展，利用基因重组技术来生产木聚糖酶已逐渐成为热点[5-6]。我国对木聚糖酶的研究集中于对菌株的改造，仍停留在摇瓶尺度上的优化和筛选，关于其产业化的研究比较少。

笔者主要研究木聚糖酶在产业化中所遇到的问题，包括原料价格成本、发酵工艺的优化放大(如搅拌转速、空气流量)及搅拌器类型的选择等，以期为木聚糖酶的放大积累经验，将来在较短的时间以较低的成本实现产品的工业化生产。

1 材料与方法

1.1 菌种

所用菌种为产木聚糖酶毕赤酵母，由南京工业大学菌种保藏室提供。

1.2 仪器及材料

桦木木聚糖购自Sigma公司;3,5-二硝基水杨酸(DNS)购自中国医药集团上海化学试剂公司;废啤酒酵母水解液，参照文献[7]自制；其他试剂为食用级或工业级。

初始种子培养基(g/L)：葡萄糖20、酵母膏10、蛋白胨20，121 ℃灭菌30 min。

初始发酵培养基(g/L)：麦麸200、酵母膏40、吐温-80 2，121 ℃灭菌30 min。

50 L发酵罐为南京新凯龙生物工程有限公司提供。

1.3 酶活的测定

采用DNS法，参照文献[8]。

1.4 培养方法

1.4.1 种子培养

取培养斜面1支，用无菌水冲洗出来，通过火焰接种法接入5 L罐中，通过摇瓶实验发现种子和发酵的培养条件基本相同，故采用5 L罐的发酵培养条件来培养种子[9]。

1.4.2 发酵培养

种子液以10%的接种量压入50 L发酵罐，初始pH为5.5，在30 ℃培养18 h 后流加甲醇。

1.5 原料替代

酵母浸膏在种子培养基和发酵培养基中的含量很高，其市场均价在20 000元/t左右，将造成原料成本过大，并且酵母浸膏因厂家和生产工艺的不同，质量也有差异，易造成发酵不稳定。因此本实验对采购的啤酒酵母进行酸水解用以制备酵母水解液[7]，取代酵母浸膏。发现产生的水解液在低pH下可长时间保存，发酵时用CaO代替NaOH溶液调解pH，一方面可以降低成本，另一方面能中和产生的CaSO4，可以保持发酵液盐浓度的稳定。

设置水解液的质量浓度分别为75、82、89、96 g/L在5 L罐中进行优化，发酵80 h后每隔4 h取样，根据酶活最大原则确定最优替代浓度和发酵时间。

1.6 搅拌转速的放大和优化

根据不同的放大原则，计算的转速也不同，首先根据不通气条件下等体积功率进行放大，按式(1)[10]计算，得出转速为242 r/min；如根据发酵液最大线速度相等的原则按式(2)[10]进行放大，则运算出的转速为167 r/min。 设计4组实验对转速进行优化，分别为160、190、220、250 r/min。

(1)

S1=S2=πD1N1=πD2N2

(2)式(1)和(2)中：P1和P2为搅拌功率,W;V1和V2为装料体积,m3;K为功率常数因子;D1和D2为搅拌直径,m；N1和N2为搅拌转速,r/s；S1和S2为搅拌器末端线速度,m/min;ρ为流体密度,kg/m3。

1.7 通气流量的放大和优化

空气流量若根据单位体积流量相等的原则进行放大，则空气流量根据式(3)计算为30 L/min，如根据单位为面积通量相等的原则按式(4)计算，则为9.3 L/min。因此设计4组实验对流量进行优化，分别为9、16、23、30 L/min。

Q1/V1=Q2/V2

(3)

Q1/[π/(D1/2)]2=Q2/[π/(D1/2)]2

(4)

式中：Q1和Q2为通气流量，L/min。

1.8 搅拌器的节能组合

引入轴流搅拌器，对降低能耗和改善轴向混合能力进行探索，为后续放大积累经验。底层搅拌采用六平叶涡轮搅拌器，上层搅拌分别采用三叶螺旋桨和六箭叶圆盘涡轮搅拌器。

2 结果与讨论

2.1 最佳酵母水解液添加量的实验

根据1.5安排实验，结果见表1。

表1 水解液含量对木聚糖酶发酵的影响Table 1 Effects of hydrolysate concentration on xylanase fermentation

由表1可知：用82 g/L酵母水解液替代40 g/L的酵母浸膏产酶最高，达到2 816 U/mL，发酵时间比使用酵母浸膏提前14 h[9]。这可能是因为酸水解酵母比酶水解更彻底，水解液中含有的游离氨基酸、小肽等小分子更多，更易被毕赤酵母快速利用。

啤酒酵母粉市场价格在4 000～6 000元/t，而每吨酵母粉能生产7 t左右的水解液，加上其他辅助材料，每吨啤酒酵母水解液的成本为700～1 000元，因此取代后，有机N源的原料成本可节约90%以上。

2.2 5 L搅拌罐中毕赤酵母的生长曲线

酵母水解液取代种子培养基中的酵母浸膏，按1.4.1方式培养，结果见图1。

图1 5 L罐中种子生长曲线Fig.1 Growth curves of seed in 5 L fermenter

图1中显示，在5 L罐中，种子在8 h左右进入快速生长期，在19 h减缓，过了20 h后增速大幅下降，A600也超过了30，因此选用20 h左右接种。

2.3 搅拌转速的优化

根据1.4.2所述的条件，在通气量1∶1条件下进行优化转速，结果见表2。

表2 搅拌转速对木聚糖酶发酵的影响Table 2 Effects of stirring speed on xylanase fermentation

由表2可知：转速在220 r/min时的酶活最高，即最佳搅拌转速高于依搅拌末端线速度相等计算的搅拌转速，而低于并且较接近于无通气条件下的单位体积搅拌功率相等而计算的搅拌转速，因此在更大级别上的优化将依据后者进行放大。

2.4 空气流量的优化

在搅拌转速为220 r/min条件下进行通气量优化，结果见表3。

表3 通气速率对木聚糖酶发酵的影响Table 3 Effects of ventilation rate on xylanase fermentation

由表3可知：通气量在23 L/min条件下，发酵酶活最高为2 864 U/mL，在此条件下的泡沫产生量少。通气比由5 L玻璃罐中的1∶1下降到0.77∶1[9]，可能与反应器的高度增加有关，另一方面50 L或以上发酵罐为了达到更好的无菌要求，罐内都会保持0.04 MPa左右的压力，压力的提高有助于增加氧在发酵液中的溶解度，从而提高溶氧。

2.5 搅拌器的节能组合

按照1.8所述的搅拌器组合进行试验。发现上层采用三叶螺旋型搅拌桨时，发酵液液面大幅升高，虽然降低了功率，但装液系数大幅下降；而采用箭叶涡轮搅拌器，液面升高不明显，搅拌功率由0.41 kW 降低到0.36 kW，连续发酵两罐，发酵酶活分别为2 858和2 876 U/mL，与原发酵单位无显著差别。

3 结 论

在50 L发酵罐上对毕赤酵母产木聚糖酶进行放大，为将来大规模的放大和生产提供经验上的指导，实验也表明搅拌转速易采用等体积功率进行放大，然后逐步降低转速进行优化，通气量随着液位的升高和罐中压力增大可适当降低。

笔者采用啤酒酵母水解液代替微生物专用级的酵母浸膏，使有机N源的原料成本降低90%以上，而搅拌器组合的改变，可以节省搅拌功率11%。由于条件限制，在搅拌器节能上的组合实验还有所欠缺，鉴于轴向搅拌器在节能上的巨大优势，当条件适合时，还是值得尝试的，这将成为低碳节能中一个新的研究方向。

[1] 李旭晖,吴生文,张志刚,等.木聚糖酶在特型酒生产中的应用[J].酿酒科技,2011(5):65-68.

[2] 陈海华,李国强.木聚糖酶对面粉糊化特性和面包品质的影响[J].粮油食品科技,2010,18(1):10-12.

[3] 董璐,李新平,叶申凤.木聚糖酶预处理对磨浆能耗和成纸性能的影响[J].纸和造纸,2010,29(1):68-70.

[4] 李洁,潘安中.碱性木聚糖酶给力纺织[J].江苏纺织,2011(6):31-33.

[5] 裴建军,李迅,李相前,等.大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质[J].无锡轻工大学学报,2004,23(4):94-97.

[6] 王金华,穆跃林,黄遵锡.基因工程酵母产木聚糖酶(XylA)的性质初探[J].饲料研究,2003(7):7-9.

[7] 蔡恒,陆彬,万红贵,等.L-鸟氨酸发酵用培养基的改进研究[J].食品与发酵工业,2007,33(7):14-16.

[8] 万红贵，李喜连，贾伟.毕赤酵母木聚糖酶的活力测定条件研究[J].发酵与食品工业,2007,33(9):150-153.

[9] 王涛,万红贵,蔡恒,等.毕赤酵母发酵产木聚糖酶条件研究[J].中国酿造,2009(7):86-89.

[10] 刘振宇.发酵工程技术与实践[M].上海：华东理工大学出版社,2007.

(责任编辑 周晓薇)

Scale-up of procedure for xylanase fermentation in 50 L fermenter

LU Bin1，WAN Honggui2

(1.Jiangsu Tong Kai Zhao Feng Biotechnology Co.,Ltd,Nanjing 211800,China;2.Jiangsu Provincial Innovation Center for Industrial Biotechnology,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Yeast hydrolysate was used instead of yeast extract as organic nitrogen source in xylanase fermentation,thus reducing the raw material costs.Scale-up of the fermentation in 50 L fermenter was investigated.The optimal conditions of stirring rate,ventilation,initial pH,temperature, and tank pressure were 220 r/min,23 L/min,5.5,30 ℃ and 0.04 MPa,respectively.The yield of xylanase reached 2 864 U/mL.Taking arrow leaf disc turbine agitator in place of flat leaf disc turbine agitator at the front of agitator shaft,the yield of xylanase had no significant change,but stirring power had declined by 11%.

fermentation;Pichiapastoris;scale-up;xylanase

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.012

2012-09-13

陆 彬(1982—)，男，安徽亳州人，工程师，研究方向：生物制品的发酵及提取；E-mail:lu_bin1982@126.com

TQ925

A

1672-3678(2014)02-0063-03