7种广西产甜茶抗氧化活性的比较

潘慧敏，王婉莹，许利嘉，肖培根

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室,北京100193)

7种广西产甜茶抗氧化活性的比较

潘慧敏，王婉莹，许利嘉，肖培根

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室,北京100193)

通过清除二苯代苦味酰基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法、铁离子还原测定(ferric reducing antioxidant power，FRAP)法、亚铁离子螯合(ferrous ion-chelating，FIC)法、β-胡萝卜素-亚油酸法等4种体外抗氧化活性测定方法，首次比较了3种茶科属茶叶和7种广西产甜茶水提物的抗氧化活性，同时用Folin-Ciocalteus法测定了其总多酚的含量。研究结果表明，多穗柯甜茶和藤茶的总多酚含量高于其他供试品。藤茶具有很好的清除DPPH·的能力，高于绿茶及阳性对照水溶性维生素E(Trolox)和人工合成抗氧化剂二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)。甜叶菊茶和悬钩甜茶的金属离子螯合能力均高于绿茶。其中，黄杞和牛白藤两种植物的抗氧化活性为首次报道。由此可见，广西产甜茶均具有较高的开发利用价值，是治疗和防治慢性代谢性疾病的重要研究对象。对广西产甜茶的研究对于了解和抢救某些少数民族的历史文化具有重要意义，为别样茶的抗氧化研究奠定了基础，值得进一步探索和开发。

抗氧化活性；茶科属茶叶；总多酚；二苯代苦味酰基

广西独特的自然地理、丰富的生物多样性及多样的人文环境使得广西茶饮的种类尤为丰富。除了著名的绿茶如桂平茶，白毛茶等，在广西不少地区还有多种当做茶饮的植物，其中某些口感发甜的植物，在当地习惯当作甜茶用，属于别样茶的范畴。其中，7种广西产最常见的甜茶(表1)具有降糖降脂作用[1]，功能可能与其抗氧化活性有关，抗氧化物质能有效清除内源性和外源性自由基，有效防止自由基所导致的各种疾病如肿瘤、心脑缺血、动脉粥样硬化等[2]。

本研究中，采用4种不同的反应机理(DPPH法、FIC法、FRAP法以及β-胡萝卜素法)综合考察了广西7种甜茶水提物的抗氧化活性，并与茶科属绿茶、乌龙茶和红茶比较，同时用Folin-Ciocalteus法测定供试茶叶的总多酚含量。该实验将对广西产甜茶的开发利用具有指导性意义，为了解和抢救某些少数民族历史文化提供线索，为别样茶的抗氧化研究奠定基础。

表1 7种广西产甜茶原植物来源

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

绿茶为西湖龙井，乌龙茶为安溪铁观音，红茶为武夷山金骏眉，原植物均为Camelliasinensis(L.)Kuntze，均购于当地。7种广西产甜茶样品见表1，均采购于广西省。以上样品均由中国医学科学院药用植物研究所肖培根研究员鉴定。

1.1.2 试剂

Folin-Ciocalteus试剂、1,2-二苯基-乙-三硝基苯肼(DPPH)、二丁基羟基甲苯(BHT)、水溶性维生素E(Trolox，6-hydroloxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、吐温-40，均为美国Sigma公司产品;2，4，6-三吡啶三嗪(TPTZ)、菲洛嗪，瑞士Fluka公司；β-胡萝卜素和亚油酸，中国药品生物制品检定所；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

MQX200型酶标仪，美国伯腾公司；AL-204 型千分之一电子分析天平，美国梅特勒-托利多公司；KQ5200E 型超声仪，昆山超声仪器厂；UV2550型紫外光谱仪，日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品粗提物的制备

准确称取粉碎过筛的各供试样品，用沸水以茶水比1∶10(g/L)于95 ℃水浴中超声提取30 min，取上清液，剩余残渣重复以上操作2次，合并上清液，经浓缩、冷冻干燥得到样品粗提物。

1.3.2 总多酚含量的测定

总多酚(TPC)含量测定采用Folin-Ciocalteus法[3]，略有改进。将样品粗提物配成2.5 mg/mL待测液，取300 μL待测液与1.5 mL Folin-Ciocalteus试剂(稀释10倍)混匀，加入1.2 mL饱和Na2CO3溶液，30 ℃水浴反应30 min后冷却，测定765 nm波长处吸收度。样品中总多酚含量以没食子酸当量(GAE)表示。以吸光值为纵坐标，没食子酸质量浓度(mg/L)为横坐标绘制校准曲线：y=0.011 1x-0.004(R2=0.999 7)。

1.3.3 DPPH·清除能力的测定

参照Miliauska等[4]的研究方法，略有改进。将2 mL的1.28×10-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液与2 mL不同质量浓度的样品待测液混合，摇匀，置于室温，暗室反应30 min。以无水乙醇调零，以Trolox和BHT为阳性对照，用酶标仪测517 nm波长处吸收度(A1)，同时测定2 mL样液与2 mL无水乙醇混合液的吸收度(A2)，2 mL无水乙醇与2 mL DPPH醇溶液混合液的吸收度(A0)，每组平行测定3次，取平均值计算样品对DPPH·的清除率，计算公式：清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。依据公式计算得到的清除率，用软件GraphPad Prism计算得到样品的EC50值，即DPPH·清除率为50%时所需样品的浓度。EC50值越小，表明样品清除DPPH·的能力越强。

1.3.4 亚铁离子螯合法(FIC)

参照Singh等[5]的研究方法。将1 mL 0.1 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL不同浓度的样品待测液混匀，再加入1 mL 0.25 mmol/L的菲洛嗪溶液，反应10 min后，以去离子水为空白对照，以EDTA为阳性对照，用酶标仪测定562 nm波长处的吸光度。每组平行测定3次，取平均值计算样品的清除率，计算公式：亚铁离子螯合率=[(A0-A1)/A0]×100%，A0为空白对照的吸光度，A1为加有样品或者阳性对照后的吸光度。依据公式计算得到的清除率，用软件GraphPad Prism计算得到样品的CEC50值，即亚铁离子螯合率为50%时所需样品的浓度。CEC50值越小，表明样品抗氧化能力越强。

1.3.5 铁离子还原测定(FRAP)法

FRAP法的原理是基于具有抗氧化活性的物质将Fe3+还原成Fe2+的能力，因Fe2+与三吡啶三嗪(TPTZ)反应呈现明显的蓝色，并在593 nm波长处有最大吸收峰，通过吸光度的大小可以判断待测抗氧化能力的强度。样品的总抗氧化能力以FeSO4标准溶液的浓度表示，该值越大，表明抗氧化能力越强。

参照Benzie等[6]的研究方法。将新配制的900 μL FRAP溶液在37 ℃下保温，与90 μL双蒸水、30 μL样品待测液(1 mg/mL)混合，混匀后37 ℃反应10 min, 以去离子水为空白对照，以Trolox和BHT为阳性对照，用酶标仪测定593 nm波长处的吸收度。每份样品平行操作3次，取平均值计算。以吸收度为纵坐标，FeSO4标准溶液的浓度(mmol/L)为横坐标绘制标准曲线y=0.393x+0.109(R2=0.999 5)。结合样品质量浓度(1 mg/mL)，样品的总抗氧化能力换算成FeSO4标准溶液的浓度，即mmol/g表示。

1.3.6 对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制实验

β-胡萝卜素易被氧化而褪去黄色，在反应体系中亚油酸氧化产生的过氧化物使β-胡萝卜素褪色，当反应体系中有抗氧化剂时，褪色速度缓慢，且褪色程度与抗氧化活性呈负相关。

参照Velioglu等[7]的研究方法。将β-胡萝卜素(0.2 mg溶于1 mL氯仿中)、亚油酸(0.02 mL)和吐温40(0.2 mL)加入到圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上40 ℃水浴加热去除氯仿，再加入50 mL蒸馏水，剧烈振荡摇匀，成乳状液。吸取2 mL乳悬液，加入0.2 mL样品待测液(0.8 mg/mL)，以去离子水为空白对照，以Trolox和BHT为阳性对照，用酶标仪测定470 nm波长处的吸收度。反应液在50 ℃水浴中继续加热100 min后，用酶标仪再次测定一次470 nm波长处的吸收度，每组平行测定3次，抗氧化活性用下式表示：

β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系褪色抑制率

AA=[1-(A0-A100)/ (A0c-A100c)] ×100%

式中：A0、A100为反应开始和100 min后的样品或阳性对照的吸光度；A0c、A100c为反应开始和100 min后的空白对照的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 总多酚含量

供试样品的总多酚含量见表2。由表2可知：多穗柯甜茶(137.16 mg/g)和藤茶(128.37 mg/g)的总多酚含量高于绿茶(126.12 mg/g)、铁观音(103.6 mg/g)、金骏眉(69.03 mg/g)及其他样品。总多酚含量由高到低依次为：多穗柯甜茶、藤茶、绿茶、铁观音、金骏眉、甜叶菊茶、悬钩甜茶、黄杞茶、相思藤茶、牛白藤茶。

2.2 DPPH·的清除能力

对供试样品清除DPPH·能力的研究结果见表2。由表2可知：藤茶具有很好地清除DPPH·的活性，活性高于供试的茶科属茶叶、阳性对照及其他甜茶。在研究的7种广西产甜茶中，藤茶(EC50为4.059 μg/mL)表现出最好的清除DPPH·的能力，多穗柯甜茶(17.42 μg/mL)清除DPPH·的能力仅次于绿茶、铁观音及阳性对照品；而相思藤茶和牛白藤茶的活性最差(>500 μg/mL)；样品及阳性对照品对DPPH·的清除能力由高到低排序为：藤茶、绿茶、铁观音、Trolox、BHT、多穗柯甜茶、悬钩甜茶、甜叶菊茶、金骏眉、黄杞茶、相思藤茶及牛白藤茶。

2.3 螯合亚铁离子能力

对供试样品的金属离子螯合能力的研究结果见表2。由表2可知：除牛白藤茶(>5 000 μg/mL)外，其余样品均表现出一定的金属离子螯合能力。其中，甜叶菊茶的EC50最低(516.6 μg/mL)，表明其金属离子螯合能力最强，优于其他甜茶及供试的茶科属茶叶，甚至是阳性对照品EDTA。悬钩甜茶(796.4 μg/mL)也表现出较绿茶(851.7 μg/mL)强的金属离子螯合能力，藤茶(903.3 μg/mL)和多穗柯甜茶(921.5 μg/mL)的活性仅次于绿茶。样品及阳性对照品的金属离子螯合能力由高到低排序为：甜叶菊茶、EDTA、悬钩甜茶、绿茶、藤茶、多穗柯甜茶、铁观音、金骏眉、黄杞茶、相思藤茶、牛白藤茶。

2.4 还原铁离子的能力测定

对供试样品的还原铁离子能力的研究结果见表2。由表2可知：藤茶(0.444 mmol/g)还原铁离子的能力与阳性对照品Trolox(0.446 mmol/g)相近，高于绿茶、铁观音、金骏眉、其他供试甜茶及阳性对照品。牛白藤茶及相思藤茶还原铁离子的能力远差于其他样品及阳性对照品。

样品及阳性对照品的还原铁离子能力由高到低排序为：Trolox、藤茶、绿茶、金骏眉、多穗柯甜茶、铁观音、BHT、悬钩甜茶、甜叶菊茶、黄杞茶、牛白藤茶、相思藤茶。

2.5 对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制作用

供试样品对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制作用的研究结果见表2。由表2可知：绿茶(90.3%)的抑制率最高，藤茶(86.5%)的抑制率仅次于绿茶，其次是铁观音(80.5%)、甜叶菊茶(69.7%)。多穗柯甜茶(67.9%)的抑制率与金骏眉相近，相思藤茶(28.4%)的抑制率最低。样品及对照品的抑制率由高到低排序为：绿茶、藤茶、BHT、铁观音、Trolox、甜叶菊茶、多穗柯甜茶、金骏眉、悬钩甜茶、黄杞茶、牛白藤茶、相思藤茶。

表2 7种广西产甜茶及3种茶科属茶叶的TPC、EC50 (DPPH)、CEC50 (FIC)、FRAP和AA测定值

注：每个值均被表示为平均数±标准差(n=3)，同列中相同的小写字母表示无显著性差异(P<0.05)。

2.6 不同测定方法间相关系数的研究

每种方法测定值间的Pearson′s相关系数见表3。由表3可知，总多酚含量与DPPH·(r=-0.886)、FRAP(r=0.844)、β-胡萝卜素-亚油酸体系(r=0.826)密切相关，与FIC(r=-0.592)相关性较小。同时有研究表明[8]，金属离子螯合能力与总多酚的化学结构有关，取决于酚类化合物的邻二羟基芳香部分，综合以上研究表明总多酚含量是决定抗氧化活性高低的重要指标。

DPPH·及FRAP不仅与总多酚含量明显相关(r=-0.886,r=0.844)，并且2种方法之间也具有很大的相关性(r=-0.801)，表明茶叶水提取物中的总多酚可能兼具氢供体以及电子供体的功能以发挥其抗氧化的作用。

表3 不同方法测定值间的相关系数

注：*表明2个变量之间具有极大的相关性(p<0.05)。

2.7 对7种广西产甜茶抗氧化活性的总体分析

本文比较了7种广西产甜茶及3种市售茶叶(绿茶、乌龙茶和红茶)的抗氧化活性。研究表明，多穗柯甜茶及藤茶的总多酚含量高于其他供试品，同时，藤茶具有很高的清除DPPH·的能力，高于绿茶及阳性对照Trolox和人工合成抗氧化剂BHT。甜叶菊茶及悬钩甜茶具有很好的金属离子螯合作用，高于供试的茶科属茶叶，其他甜茶的活性均低于绿茶、乌龙茶及红茶。相关性分析表明，总多酚是茶叶具有抗氧化活性的关键物质。

绿茶、乌龙茶、红茶为目前世界上产量和应用量最大的几个茶叶品种，因其口感佳、抗氧化性和生物活性高而被广泛接受，其卓越的抗氧化活性也在本文中再次得到验证。本研究表明多穗柯甜茶及藤茶，其总多酚含量高于绿茶、铁观音和金骏眉，藤茶的DPPH·清除能力和还原铁离子的能力均高于供试的茶科属茶叶，甜叶菊茶及悬钩甜茶的金属离子螯合作用也明显高于其他样品，可以干扰金属离子在脂质氧化过程中的催化作用，抗氧化作用卓越。

牛白藤茶及相思藤茶在4个体外抗氧化实验中，活性远低于其他样品以及阳性对照品，抗氧化能力较弱。但有报道表明，牛白藤具有清热解暑、消炎止痛的功效，同时具有调节免疫、抗诱变、抗肿瘤、抗菌消炎等作用[9]。而相思藤茶提取物能通过诱导MDA-MB-231细胞的凋亡而起到生长抑制的作用，对于乳腺癌的治疗具有潜在价值[10]。

3 结 论

广西产甜茶是一类重要的别样茶，长期被多个少数民族饮用。但是随着社会的发展，甜茶逐渐被淘汰，具有民族特色的应用经验逐渐消失。因此，对广西产甜茶的研究对于了解及进一步抢救某些少数民族的历史文化具有重要意义。由于甜茶中的总多酚类成分，使其或多或少具有抗氧化的活性，为别样茶的抗氧化研究奠定了基础，创造了条件。同时，现代药理学研究表明它们在降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤等方面有突出表现，长期饮用能够对慢性的代谢类疾病起到良好的保健预防作用，是防治和治疗慢性代谢性疾病的重要研究对象，值得进一步研究和开发，从而促进我国茶文化多样性的发展，也能为别样茶在世界范围内更为广泛的应用提供科学依据。

[1] Koh G Y,McCutcheon K,Zhang F,et al.Improvement of obesity phenotype by Chinese sweet leaf tea (Rubussuavissimus) components in high-fat diet-induced obese rats[J].J Agric Food Chem,2011,59(1):98-104.

[2] Marx J L.Oxygen free radicals linked to many diseases[J].Science,1987,235:529-531.

[3] Obanda M,Owuor P O,Taylor S J.Flavanol composition and caffeine content of green leaf as quality potential indicators of Kenyan black teas[J].J Sci Food Agric,1997,74(2):209-215.

[4] Miliauskas G,Venskutonis R,Van Beek T A.Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts[J].Food Chem,2004,85(2):231-237.

[5] Singh N,Rajini P S.Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel[J].Food Chem,2004,85(4):611-616.

[6] Benzie I F,Strain J J.The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power":the FRAP assay[J].Anal Biochem,1996,239(1):70-76.

[7] Velioglu Y S,Mazza G ,Gao L,et al.Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits,vegetables and grain products[J].J Agri Food Chem,1998,46(10):4113-4117.

[8] Andjelkovic M,van Camp J,De Meulenaer B,et al.Iron-chelation properties of phenolic acids bearing catechol and galloyl groups[J].Food Chem,2006,98:23-31.

[9] 斯建勇,陈迪华,潘瑞乐,等.耳草属植物化学成分及药理活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2007,19(3):517-523.

[10] Shafi S M,Sateesh M K,Bashir M,et al.Cytotoxic and pro-apoptotic effects ofAbrusprecatoriusL.on human metastatic breast cancer cell line,MDA-MB-231[J].Cytotechnology,2013,65(3):407-417.

(责任编辑 周晓薇)

Antioxidants of seven types of sweet teas in Guangxi

PAN Huimin,WANG Wanying,XU Lijia,XIAO Peigen

(Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100193,China)

To compare the primary antioxidant activities of seven sweet teas from Guangxi, we studied primary antioxidant activities of those tea based on four different reaction mechanisms,i.e.,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity, ferric-reducing antioxidant power (FRAP), ferrous ion-chelating (FIC) andβ-carotene-linoleate bleaching assays. In addition, the total polyphenol content of each sample was estimated by Folin-Ciocalteus assay. Results show that the total polyphenol contents of Shilitiancha and Tengcha were higher than the other samples. The DPPH radical scavenging activity of Tengcha was superior to that of Green teas and positive controls Trolox and butylated hydroxytoluene(BHT). The metal chelating capacity of Tianyejucha and Xungou tiancha was exceptionally stronger than that of green teas. Especially, the antioxidant activities of HuangQi and NiuBaiTeng were reported for the first time. The potential application of antioxidant sweet teas needs further to explored.

antioxidants activities;Camelliasinensis;total polyphenol；1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.017

2014-03-18

国家自然科学基金面上项目(81274188)

潘慧敏(1989—)，女，内蒙古包头人，硕士生，研究方向：药用植物资源化学；许利嘉(联系人)；副研究员，E-mail：xulijia@hotmail.com

R285.5

A

1672-3678(2014)06-0090-06