大米过敏蛋白的研究进展
2014-02-08李海飞高金燕袁娟丽李晶晶陈红兵
李海飞,高金燕,袁娟丽,舒 恒,芦 军,李晶晶,陈红兵
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西 南昌 330047;3.南昌大学生命科 学与食品工程学院,江西 南昌 330047)
大米过敏蛋白的研究进展
李海飞1,2,3,高金燕3,袁娟丽1,2,3,舒 恒1,2,3,芦 军1,2,3,李晶晶1,2,3,陈红兵1,2,*
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047;2.南昌大学中德联合研究院,江西 南昌 330047;3.南昌大学生命科 学与食品工程学院,江西 南昌 330047)
大米蛋白可引起食物过敏,激发由IgE介导的速发型超敏反应和主要由T细胞介导的迟发型超敏反应。本文介绍大米中可导致食物过敏的主要蛋白:即14~16 kD的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂蛋白、磷脂转移蛋白和33 kD具有乙二醛酶Ⅰ活性的蛋白。此外,本文还对预发芽结合加热处理、超高压技术、酶解等可降低大米过敏蛋白致敏性 的加工工艺进行阐述,其中,酶解是一种相对成熟的加工方法,能有效降解大米过敏蛋白。预发芽结合加热处理与超高压技术是新兴的食品加工技术,两者均可不同程度地降低大米过敏蛋白的含量。
食物过敏;大米蛋白;脱敏加工
稻米是亚洲国家和一些西方国家的主食。在谷物类蛋白中,大米蛋白质量最优,主要表现在:大米蛋白中各种必需氨基酸的构成比例接近FAO/WHO建议的模式;生物价高,达到77,可以和优质动物蛋白相媲美;较易消化,消化率为85%,高于大部分谷物蛋白,且不含胆固醇。因此,大米蛋白越来越受欢迎,被广泛用于婴幼儿配方食品中,特别是在韩国,米粥是婴幼儿首选的断奶食品。但同时,在一部分人群中,大米蛋白也可能诱发过敏反应。如1979年Shibasaki等[1]首次报道了大米中的球蛋白具有高致敏性,可引发过敏性皮炎、过敏性皮疹等疾病。随后有关大米过敏的病例报道日益增多,且不仅摄食大米及其制品可引发过敏反应,接触生米或是吸入大米煮沸时释放的蒸汽也可能诱发荨麻疹、结膜炎和哮喘等症状[2]。因此,开展对大米过敏蛋白的研究对大米过敏患者来说显得尤为重要。本文归纳分析大米主要过敏蛋白种类及其引发过敏反应的机制,并介绍降解大米过敏蛋白致敏性的加工方法,以期为开展大米过敏蛋白的相关研究提供参考信息。
1 大米中蛋白的组成分类
大米中的蛋白主要存在于稻谷的胚乳中,并以PB-Ⅰ和PB-Ⅱ两种聚集体的形式存在,两种聚集体常相伴存在。通过电子显微镜观察,可见PB-Ⅰ聚集体呈片层结构,致密颗粒直径为0.5~2 μ m,醇溶蛋白主要存在于PB-Ⅰ聚集体中;而PB-Ⅱ聚集体呈椭圆形,质地均匀,不分层,颗粒直径约为4 μm,外周膜不明显,谷蛋白和球蛋白主要存在于PB-Ⅱ聚集体中。
大米中蛋白质的相对含量为8%~10%。按Osbome分类方法,大米蛋白根据其溶解性可分为4类:溶于水的清蛋白,含量为总蛋白的2%~5%;盐溶性球蛋白,含量为总蛋白的2%~10%;溶于稀酸或稀碱的谷蛋白,含量占总蛋白的80%以上;溶于乙醇的醇溶蛋白,含量为总蛋白的1%~5%。4 类蛋白的营养价值按照化学评分分别为47.5、53.0、46.7和23.0。在大米蛋白中,赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸和含硫氨基酸的相对含量较低,为大米 蛋白中的限制性氨基酸,其氨基酸分值分别为65.1、66.3、78.9和67.9[3]。
2 大米中主要过敏蛋白
根据Pfam蛋白质家族数据库,植物性食物过敏原可分为Cupin超家族、醇溶谷蛋白超家族、Bet V1家族和抑制蛋白超家族4 个家族[4]。Chen Xiaowei等[5]通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳得出大米蛋白的分子质量主要在10~100 kD之间,其中包括14~16、26、33、56、60 kD等不同分子质量大小的过敏蛋白[6]。比较常见的有14~16 kD的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂、磷脂转移蛋白、33 kD具有乙二醛酶Ⅰ活性的蛋白等过敏蛋白。
2.1 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂
大米中分子质量为14~16 kD的过敏蛋白属于清蛋白/球蛋白。从这些蛋白中,Matsuda等[7]分离出分子质量为16、15.5、14 kD的3 种蛋白,等电点分别为6.3、6.5、7.9。Izumi等[8]则进一步分析出16 kD过敏蛋白中二硫键的连接方式如图1所示,5 个分子内二硫键的存在使16 kD蛋白质的多肽结构保持相对稳定,使其具有高的热稳定性且不易被消化。Angelina等[9]推断出14~16 kD过敏蛋白的氨基酸序列,尤其是其中半胱氨酸残基的数目和位置,与小麦和大麦蛋白中的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂非常相似;同时,也证实了这些大米过敏蛋白可抑制人的唾液淀粉酶。而α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂则被认为是引起面包师哮喘的主要过敏原,属于植物性食物过敏原中的醇溶谷蛋白超家族。
大米14~16 kD 过敏蛋白包括RAG1、RAG2和RA5基因片段,其中RAG1(recombination activating gene 1)被认为是大米中主要过敏原,它编码大米16 kD蛋白[10]。李燕芳等[11]通过DNAStar Protean生物信息学软件采用多方案和多参数分析RAG1 的氨基酸序列,预测其二级结构和B细胞表位,得出了第33~44、119~129、155~163区段可能是B细胞的优势表位。
图1 16 kD的大米过敏蛋白抗原决定簇的假定的片状结构[8]Fig.1 Putative epitope laminar structure of 16 kD allergen protein in rice[8]
2.2 磷脂转移蛋白
磷脂转移蛋白是一种主要的蔷薇科过敏原,是多种可食性植物中的常见过敏原,分为非特异性的1型磷脂转移蛋白和2型磷脂转移蛋白,属于植物性食物过敏原中的醇溶谷蛋白超家族。大米中的磷脂转移蛋白分子质量为9 kD,也有报道认为分子质量为14 kD,包含有91~95个氨基酸残基,结构中含有4 个二硫键使此过敏蛋白具有高度稳定的三维结构,对热、酸和胃蛋白酶稳定,具有高等电点[12]。能与多种食物发生交叉过敏反应[13]。
2.3 其他过敏蛋白
随着对大米过敏蛋白研究的不断深入,越来越多的过敏蛋白被发现,如属于2S清蛋白家族的分子质量为19 kD的大米过敏蛋白;大米储存蛋白中的26 kD的α-球蛋白;56 kD的糖蛋白;煮米饭蒸汽中的重要过敏原33 kD(具有乙二醛酶Ⅰ活性);以及与种子储藏蛋白Cupin家族同源的52 kD和63 kD的球蛋白[14]。现将目前报道过的各种大米过敏蛋白及其所引起的临床症状总结于表1。
表1 大米过敏原及其引发的过敏反应症状Table1 Rice allergens and correspondi n g allergic symptoms
3 大米蛋白过敏反应的机制
从医学免疫学的角度,食物过敏反应根据其发生机制可分为4 种类型:Ⅰ型是由免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)IgE介导的速发型超敏反应;Ⅱ型超敏反应(细胞毒型)是由抗体直接作用于相应的细胞或组织上的抗原,在补体、巨噬细胞和NK细胞参与下,造成细胞损伤;Ⅲ型超敏反应(免疫复合物型)是由于抗原抗体复合物的沉积,引起的血管及其周围炎症;Ⅳ型是由T细胞介导的迟发型超敏反应。从广义上来说,食物过敏反应又可分为IgE介导、非IgE介导及混合型三大类,大米蛋白所引发的过敏反应主要有IgE介导和非IgE介导两 种类型[21]。
3.1 IgE介导的食物过敏反应
抗原刺激机体产生IgE抗体,当相同抗原再次入侵时就与IgE结合形成抗原抗体复合物,激发肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放出一系列生物活性介质,从而引起过敏反应。
在大米蛋白中,分子质量为9、14~16、26、32~33、56、60 kD等蛋白质引起的过敏反应是由IgE所介导的,引发途径有直接接触稻谷,吸入水稻花粉或米饭煮熟过程中产生的蒸汽,摄食米饭或大米制品等[22-23]。主要症状有皮疹、红斑、荨麻疹、血管神经性水肿、口腔过敏综合征、鼻结膜炎、哮喘、过敏性休克等。
3.2 非IgE介导的食物过敏反应
非IgE介导的食物过敏反应在临床上主要有接触性皮炎、泡疹样皮炎、直肠结肠炎、食物蛋白引发的小肠结肠炎综合征、乳糜泻等[24]。在这些过敏反应中,调节T细胞的细胞因子的缺乏及Th2细胞因子的释放是引起这类过敏反应的重要因素[25],但是有关非IgE介导的食物过敏反应的机制目前尚不清楚。
在非IgE介导的过敏反应中,食物蛋白引发的小肠结肠炎综合征是最常见的疾病之一[26]。其发病机制可能与小肠黏膜固有层中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达增加,而具肠道保护作用的细胞转移生长因子-β(ransforming growth factor-β,TGF-β)的活性减弱,导致肠道通透性增加,屏障功能降低有关[27]。T细胞可能参与这个反应。
牛奶和大豆蛋白是诱发小肠结肠炎综合征的主要食物过敏原,但是越来越多的报道显示粮食作物也会引起此类疾病,尤其是大米[28]。Caubet[29]和Leonard[30]等研究发现:大米蛋白引发小肠结肠炎综合征时,促炎细胞因子释放,TNF-α和γ-干扰素增加,从而导致肠道通透性增加、体液流失、绒毛萎缩。与IgE介导的反应迅速、过敏反应强烈相比,大米蛋白引发的小肠结肠炎综合征属于迟发型过敏反应,通常发生在摄入过敏蛋白2~4 h之后,临床症状表现为剧烈的呕吐、虚脱、腹泻,低血糖,甚至休克[31]。虽然大米蛋白是引发小肠结肠炎综合征的主要过敏原,但是有关大米蛋白引发小肠结肠炎综合征的机理尚不清楚[6],也没有指出具体是哪一种蛋白会导致小肠结肠炎综合征,所以,有关大米蛋白诱发的小肠结肠炎综合征需要更进一步的研究。
3.3 过敏原的检测方法
食物过敏原致敏性的评价方法根据场地不同分为体内法和体外法。体内法主要包括皮肤实验(skin testing,ST)、双盲安慰剂对照的食物激发实验(double-blind placebo-controlled food challenges,DBPCFC)和动物模型等。体外法又分为血清学方法和细胞学方法,血清学方法主要包括免疫印迹(immunoblotting)法、酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验、放射过敏原吸附抑制(radio-allergosorbent test inhibition,RAST抑制)实验和酶标记过敏原吸附抑制(enzyme allergosorbent test inhibition,EAST抑制)实验等;细胞学方法包括组胺释放实验(histamine releasing test,HRT)、嗜碱性粒细胞活性测试与脱颗粒实验、T细胞反应分析等。
由于有关大米过敏蛋白的研究相对较少,所以对大米蛋白致敏性检测方法尚不完善,目前常用的有双盲安慰剂对照的食物激发实验,皮肤针刺实验,体外IgE检测等方法;而体内动物实验除了Chen Xiaowei等[5]报道过建立小鼠模型研究大米致敏蛋白外,几乎没有相关研究文献。
4 加工工艺对大米过敏蛋白的影响
对于大米过敏患者而言,避免过敏原或者饮食低致敏大米制品是其主要防治方法。目前,获得低致敏大米制品可以通过生产加工得以实现,如酶解、发芽和加热处理以及超高压技术等。
4.1 酶解处理对大米过敏蛋白的影响
酶处理是利用不同酶试剂使蛋白质的多肽链和氨基酸残基发生变化,引起蛋白质结构的改变,从而达到降低大米蛋白致敏性的目的。Watanabe等[32]利用了肌动蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰酶6 种不同酶水解大米蛋白,并对水解后的蛋白进行了RAST实验和临床检测,结果显示:经肌动蛋白酶水解后的大米蛋白,其主要过敏原(球蛋白)大量降解,且大多数的RAST值呈阴性,同时,临床实验还表明,多数对大米过敏的患者食用肌动蛋白酶水解后的大米无过敏症状。陈宝宏等[33]对木瓜蛋白酶分解大米过敏原进行单因素和响应面实验得出,木瓜蛋白酶制备低致敏大米的最佳条件为温度39 ℃、pH 7.45、时间25 h,酶添加量132.93 mg/5 g。
4.2 发芽和加热处理对大米过敏蛋白的影响
大米种子在发芽的过程中,很多内源性蛋白酶被激活,可降解大米蛋白,在这些蛋白中,可溶性蛋白比储藏蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白更容易被降解。Yamada等[34]对大米种子进行预发芽和加热干燥处理后发现,发芽后的种子内源性蛋白酶活性增加了1.5倍,它们大量分解可溶性蛋白,包括14~16 kD和26 kD的过敏蛋白;该研究还表明,在30 ℃条件下让大米吸水22 h进行预发芽后,14~16 kD的过敏蛋白降低了70%,进一步在100 ℃下加热5 min,几乎检测不出其致敏性;同时,pH值也能影响过敏蛋白的降解,pH值为4时,26 kD的过敏蛋白大量降解,pH值为5~7时,14~16 kD过敏蛋白明显降解;此外,添加少量去污剂也可促进过敏蛋白的降解。因此,利用发芽和加热干燥相结合的加工工艺可以有效降低大米中过敏蛋白的含量。
4.3 超高压对大米过敏蛋白的影响
自Bridgman[35]研究发现蛋白质在500 MPa下凝固,700 MPa下可形成凝胶以来,超高压技术逐步地被广泛应用于食品工业中,不仅可杀死或钝化食品中的微生物和酶,延长货贺期,而且可降低食品中的过敏原。 超高压技术用于降低大米过敏蛋白含量,生产低过敏大米制品,其可能的机制为通过高压破坏大米胚乳细胞,使提取液趁机渗入到细胞里面溶解蛋白,随后释放到周围的溶液中,从而降低大米过敏蛋白的含量。Kato等[36]研究了超高压对大米中过敏蛋白致敏性的影响,将大米置于蒸馏水中并在100~400 MPa的压力下进行加压处理,当压力增加到300 MPa时,大量蛋白释放出来,主要过敏蛋白如16 kD的清蛋白、α-球蛋白和33 kD的球蛋白也被部分降解,若将酶解与超高压技术相结合,这些过敏蛋白几乎完全被降解。此外,徐洲等[37]对超高压消除大米过敏原的机理,处理条件及影响因素进行了综述,并指出压力、浸泡大米的提取液、提取液浓度、浸泡时间、提取温度等对大米过敏蛋白的溶解、释放和降解的影响也至关重要。
5 结 语
大米虽然不是八大常见食物过敏源之一,但在婴幼儿中,由于摄食米粥而引发的小肠结肠炎综合征数见不鲜。目前,人们对于大米过敏蛋白及引发过敏反应的机制和症状有了一定的认识,但并不全面,如引起小肠结肠炎综合征的过敏蛋白尚未确定;大米过敏蛋白的提取方法需要改进;大米蛋白的过敏机制有待阐明;大米过敏蛋白的检测方法不够完善;生产低致敏大米的加工工艺需要更进一步的研究和拓展等。特别是在国内,对于大米过敏蛋白的研究很少。因此,开展对大米过敏蛋白的研究具有重要的理论价值和实际意义。
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Progress in the Study of Allergenic Proteins in Rice
LI Hai-fei1,2,3, GAO Jin-yan3, YUAN Juan-li1,2,3, SHU Heng1,2,3, LU Jun1,2,3, LI Jing-jing1,2,3, CHEN Hong-bing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
Rice protein can trigger food allergy, stimulate IgE-mediated immediate hypersensitivity and T cell-mediated delayed-type hypersensitivity. The major allergens in rice include 14 16 kD α-amylase/trypsin inhibitor, lipid transfer protein and the 33 kD protein with glyoxalase Ⅰ activity. Besides, this paper also describes three processing techniques that can lower the sensitization of allergic proteins in rice, including pre-ge rmination combined with heat treatment, ultra high pressure (UHP) technology and enzymatic degradation. Enzymatic degradation is a matured method that can effectively reduce the content of allergic proteins in rice. Pre-germination combined with heat treatment and UHP technology are emerging processing methods, and both meth ods can reduce the content of rice allergic proteins at different levels.
food allergy; rice protein; desensitization processing
TS213.3
A
1002-6630(2014)23-0308-05
10.7506/spkx1002-6630-201423060
2014-06-28
国家国际科技合作专项(2013DFG31380);国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102205);江西省自然科学基金重点项目(2 0 1 3 3 AC B 2 0 0 9);南昌大学食品科学与技术国家重点实验室项目(SKLF-ZZA-201302;SKLF-ZZB-201302)
李海飞(1989—),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:lihaifei1989@gmail.com
*通信作者:陈红兵(1967—),男,教授,博士,研究方向为食品营养与安全。E-mail:chbgjy@hotmail.com