基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重组果胶酶的纯化及酶学性质

徐 伟，姚晓静，付大伟

（哈尔滨商业大学食品工程学院，食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-pel重组果胶酶的纯化及酶学性质

徐 伟，姚晓静，付大伟

（哈尔滨商业大学食品工程学院，食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076）

采用超声波破碎法、镍离子亲合层析柱法，纯化重组菌Escherichia coli BL21/pET-pel表达的胞内重组果胶酶，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide pelelectrophoresis，SDSPAGE）检测，研究纯化的重组果胶酶酶学性质。结果表明：重组果胶酶纯化倍数为1.71，回收率为88.5%，分子质量约为44 kD。最适pH值为9.0～9.5，在pH 7.0～10.0之间催化性质较稳定；最适作用温度范围为45～55 ℃，在60 ℃下保温30 min还剩余40%的酶活力；在离子浓度为1 mmol/L时，Ca2+和Co2+对该酶有较强的促进作用，而Fe2+则对其有较强的抑制作用。

重组果胶酶；胞内酶；镍离子亲合层析；酶学性质

果胶酶是一类能够催化果胶质降解的复合酶。酸性果胶酶应用在果汁处理、果酒发酵等工业中，可有效促进饮品澄清和提高果汁出汁率[1-2]。碱性果胶酶则可以应用到造纸业、咖啡和茶发酵、香精和植物油萃取、工业废水处理以及纺织等工业中，代替传统脱胶工艺，既可以提高产品质量，又可以减少工业生产对环境的污染，为实现环境友好型工业做出贡献[3-5]。目前研究较多的微生物果胶酶为胞外酶，分离纯化时常先用硫酸铵沉淀，再用等电聚焦或离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等方法进行纯化；而胞内酶则需要利用超声波、酶解、去垢剂、研磨等方法破碎细胞，先释放出酶，再进行纯化[6-7]，方法繁琐。通过基因工程方法则可获得带有6-His标签的重组果胶酶，结合亲合层析法可简单有效地将其分离出来[8-9]。本实验室前期从1 株芽孢杆菌中成功扩增出一段碱性果胶裂解酶基因，并在大肠杆菌E.coli BL21中成功表达，得到重组菌E.coli BL21/pET-pel。本实验对工程菌所表达的胞内碱性果胶酶进行纯化，研究pH值、温度对酶活力和稳定性的影响，以及金属离子对酶的激活或抑制作用，进一步了解重组果胶酶的酶学性质，为其在工业生产上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

重组菌E.coli BL21/pET-pel为本实验前期构建并保存。

LB（luria-bertani）液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖10 g/L。

果胶 天津市东丽区天大化学试剂厂；Trisbase、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海榕悦生物科技有限公司；氨苄青霉素（ampicillin，Amp）、异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 天津博美科生物技术有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 北京奥博星生物技术有限责任公司；中分子质量蛋白Marker 海基生物科技有限公司；N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酞胺、考马斯亮蓝 北京博奥拓达科技有限公司；镍离子亲和层析柱填料 上海锐谷生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

PHS-5CpH计 杭州奥立龙仪器有限公司；V-5000紫外可见分光光度计 上海精科仪器销售公司；H1650-W高速离心机 湖南湘仪有限公司；DYCZ-24D双垂直电泳槽、BG-Power 300电泳仪 北京六一仪器厂；DHG-9123A凝胶成像系统 美国UVP公司产品；LDZX 50KB高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD无菌操作台 苏州净化设备有限公司；SY-2-4电热式恒温水浴锅、HNY-100B恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化与扩大培养

取本实验室甘油冷冻保藏的大肠杆菌E.coli BL21/ pET-pel菌液50 μL，接种到含LB培养基的试管中，加入100 mg/mL的Amp 5 μL，在37 ℃、150 r/min的条件下培养16 h，作为种子液备用。

以1%的接种量，将种子液转接到100 mL（250 mL三角瓶）Amp-LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min振荡培养，至菌液OD600nm达到0.6～0.8，加入100 μL 500 mmol/L的IPTG，37 ℃、150 r/min再次振荡培养6 h，得到发酵液，冷藏备用。

1.3.2 粗酶液制备

发酵液于12 000 r/min离心5 min，弃去上清液，收集菌体，将菌体重悬于体积为发酵液10%的pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl中，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率200 W，破碎时间10 min（超声波5 s，间隔10 s），12 000 r/min离心5 min，收集上清液，即为粗酶液。

李树化的这一首《如此温柔》在中国早期钢琴曲中是较为特别的一首，特别在于它的私密性内容和情感。这是他敬献给爱妻的一首“情歌”，既有西方浪漫主义情调，也兼有中国传统的“执子之手，与子偕老”的意愿。虽然是谱写在“圣诞节”期间，但是音乐并没有明显的宗教情绪，而是非常人性化和世俗化的表达。正是由于它的这个特点，所以李树化并没有将其公开发表，而是深深地收藏在自己的手稿中。西方浪漫主义音乐（尤其是钢琴音乐）中大都隐含着人类深沉而私密的情感，高尚的人文主义因素深蕴其中，这正是可贵之处。

1.3.3 重组果胶酶纯化

E.coli BL21/pET-pel表达的重组蛋白带有6-His标签，采用Ni2+亲合层析柱纯化[10-12]。用pH 7.8的20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液平衡Ni2+柱，上样3 倍柱体积的粗酶液，用pH 7.8的10 mmol/L咪唑溶液洗涤，去除杂蛋白，再用pH 7.8的200 mmol/L咪唑溶液洗脱，得到目的蛋白，收集流出液冷藏备用。

1.3.4 重组果胶酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide pelelectrophoresi，PAGE）分析

蛋白电泳胶为12%的分离胶和5%的浓缩胶，上样液为镍柱纯化的果胶酶液、粗酶液和未加入诱导剂时的E.coli BL21/pET-pel细胞裂解液，以标准分子质量蛋白作为对照，考马斯亮蓝R-250染色。

1.3.5 重组果胶酶酶活力测定

采用3,5-二硝基水杨酸法，即DNS法测定[13-14]。在试管中加入900 μL 2.5 g/L果胶底物，100 μL酶液，于50 ℃水浴10 min，加入1.5 mL DNS终止反应，在100 ℃沸水中加热5 min，冷却后于540 nm波长处测定OD值。用100 ℃加热5 min灭活的酶液作为空白对照组。结果与葡萄糖标准曲线比对，得出酶活力计算公式。规定在上述条件下，每1 min催化果胶生成1 μmol半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）；单位质量（mg）的蛋白质所具有的酶活力单位数为比活力（U/mg）。

式中：t为反应时间/min；ODi540nm为平行样光密度值；OD540nm对照样光密度值；k为标准曲线斜率；180为葡萄糖的摩尔质量/（g/mol）。

1.3.6 蛋白含量测定

采用Bradford法，即用考马斯亮蓝G-250试剂，以牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）为标准，测定蛋白含量。

1.3.7 重组果胶酶的酶学性质分析

1.3.7.1 重组果胶酶作用的最适pH值及其pH稳定性分析

在50 ℃下测定重组果胶酶在pH 7.0、8.0、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0时的酶活性，确定其最适pH值；将该酶分别在pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的条件下37 ℃水浴1 h，在pH 10.0的反应条件下测定酶活性，分析其pH值稳定性。

1.3.7.2 重组果胶酶作用的最适温度和热稳定性分析

在重组果胶酶作用的最适pH值下，分别测定其在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃条件下的酶活性；并在50、60、70、80 ℃的温度下将重组果胶酶保温5、10、20、30 min 后，于50 ℃反应10 min测定剩余酶活性，以未保温测得的酶活力定为100%，分析其热稳定性。

1.3.7.3 金属离子对重组果胶蛋白酶作用的影响

在含有1 mmol/L不同金属离子（Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Li+、Al3+）的环境中，测定重组果胶酶的酶活性，将未加金属离子的酶活力定为100%，观察金属离子对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 重组果胶酶纯化结果

表1 重组果胶酶的纯化结果Table1 Purification of recombinant pectinase

图1 重组果胶酶SDS-PAGE电泳结果Fig. 1 SDS-PAGE of recombinant pectinase

由表1可知，经镍离子亲和层析柱纯化后，酶比活力由39.63 U/mg 提高到67.58 U/mg，纯化1.71倍，回收率达88.5%。SDS-PAGE 分析如图1所示，E.coli BL21/pET-pel裂解液中蛋白条带较多，加入诱导剂后培养6 h的较未加入诱导剂的细胞裂解液在大约44 kD处出现蛋白条带，纯化后蛋白条带单一。与标准蛋白对比可知，该重组酶分子质量约为44 kD，与经Vecter NTI Explorer软件对重组果胶酶氨基酸序列进行预测分子质量相符，可确定所得纯化蛋白为重组果胶酶，且达到电泳纯。

2.2 pH值对重组果胶酶活性的影响

图2 pH值对重组果胶酶活力的影响Fig.2 Effect of pH on the activity of recombinant pectinase

图3 重组果胶酶的pH值稳定性Fig.3 pH stability of recombinant pectinase

酶催化需要其适宜的pH值环境，由图2可知，此重组果胶酶的最适pH值范围为9.0～9.5；由图3可知，在pH 7.0～10.0之间较稳定，剩余相对酶活力可保持在90%以上，而在pH 5.0以下，其稳定性迅速下降，尤其在pH 2.0、3.0时该酶几乎失去活性。

2.3 温度对重组果胶酶活性的影响

图4 温度对重组果胶酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant pectinase

图5 重组果胶酶的热稳定性Fig.5 Thermostability of recombinant pectinase

由图4可知，该酶的最适温度为50 ℃，此时酶活力可达到168.77 U/mL，最适温度范围在45～55 ℃之间，酶活力保持在160 U/mL以上，65 ℃及以上酶活性迅速下降；由图5可知，在50 ℃下保温30 min，重组果胶酶酶活性基本不变，在60 ℃保温30 min酶活力还可保持40%以上，在70、80 ℃保温30 min，酶基本失活。

2.4 金属离子对重组果胶酶活性的影响

由表2可知，在1 mmol/L 离子浓度条件下，Zn2+、Ni2+、Ca2+、Co2+和Al3+均可提高果胶酶的活性，其中Ca2+和Co2+对果胶酶的促进作用较强，分别提高66%和74%，Zn2+、Al3+和Ni2+对果胶酶的促进程度较小，分别提高16%、19%和14%。Fe3+、Fe2+、Mn2+和Cu2+对重组果胶酶活性有不同程度的抑制作用，Fe3+、Mn2+和Cu2+的抑制作用为10%左右，而Fe2+对酶有较强的抑制作用，可使重组果胶酶丧失47%的活力。Mg2+和Li+对果胶酶活性基本没有影响。

表2 金属离子对重组果胶酶活性的影响Table2 Effects of various metal ions on the activity of recombinant pectinase

3 结论与讨论

本实验用镍柱纯化重组菌胞内的果胶酶，得到电泳纯的重组果胶酶，回收率为88%，纯化倍数可达1.71；SDS-PAGE检测表明，重组酶分子质量约为44 kD，与相关文献[15-16]报道的重组果胶酶分子质量大小在38～46 kD之间相符。

已报道的碱性果胶酶最适pH值为8.0～l0.0，最适温度范围在30～80 ℃，多数为50～60 ℃[17]，不同来源的果胶酶酶学性质有一定差异。Li Zuming等[18]报道的碱性果胶酶最适反应pH值为10.0，可在pH 8.0～10.0、温度不大于40 ℃的条件下保持稳定；古丽斯玛依·艾拜都拉等[19]研究的碱性果胶酶最适作用pH值为10.0，在pH 9.0～12.0的范围内有较高活性和稳定性；Mei Yanzhen等[20]构建的工程菌表达的果胶酶最适作用pH值为10.0，在pH 9.5～10.5范围内稳定，最适作用温度为80 ℃。本研究中的重组果胶酶最适作用条件与报道的作用范围相吻合，最适反应pH值范围为9.0～9.5，条件温和，在pH 7.0～10.0之间相对稳定，范围较广泛。作用的最适温度范围为45～55 ℃，在50 ℃下保温30 min，可保持90%以上活性，热稳定性良好。

不同离子在特定条件下可以作为酶的抑制剂或催化剂。Yuan Peng等[21]报道50 μmol/L的Ca2+可以使重组果胶酶酶活提高1.8 倍，Cr3+、Pb2+可抑制果胶酶活性；Li Xiaoman等[22]研究的重组果胶酶在0.5 mmol/L Ca2+的促进下酶活可提高7 倍，Ba2+可以使其严重失活；刘丽萍等[23]研究的果胶裂解酶在Ca2+浓度为0.75 mmol/L时酶活力最高；张菊等[24]也报道Ca2+为大多数果胶酶的激活剂，Co2+和Fe2+等可抑制果胶酶活性。本研究中，在1 mmol/L离子浓度的条件下，Ca2+和Co2+使重组果胶酶酶活力提高66%～74%，可作为促进剂使用，Zn2+、Al3+和Ni2+对果胶酶的促进作用较小，Fe3+、Fe2+、Mn2+和Cu2+对重组果胶酶活力有不同程度的抑制作用，其中Fe2+对该酶有较强的抑制作用。Co2+对重组果胶酶激活作用未见报道，可能由于此酶的活性中心具有区别于其他果胶酶的基团，与Co2+作用发生了可促进酶催化的变构，从而使酶活力提高。

通过对基因工程菌E.coli BL21/pET-pel重组果胶酶酶学性质分析，该酶作用条件温和，并且在该条件下性质稳定。今后再从基因工程上进一步研究，以提高该碱性果胶酶基因的表达量，以期该酶可以工业化应用。

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Purification and Characterization of Recombinant Pectinase from Genetically Engineering Strain Escherichia coli BL21/pET-pel

XU Wei, YAO Xiao-jing, FU Da-wei
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

The recombinant pectinase expressed in Escherichia coli BL21/pET-pel was purified by ultrasonic cell disruption and nickel ion affinity chromatography, and detected using SDS-PAGE. Its enzymatic characteristics were analyzed. The results showed that purification fold of the recombinant pectinase was 1.71, and recovery was 88.5%. Molecular weight of the recombinant pectinase was approximately 44 kD. Its optimal temperature and pH were 45-55 ℃ and 9.0-9.5. It was stable at pH 7.0-10.0. When the recombinant pectinase was incubated for 30 min at 60 ℃, the relative activity was approximately 40%. Different metal ions revealed different effects on the recombinant pectinase, which was activated by Ca2+and Co2+but inhibited by Fe2+.

recombinant pectinase; intracellular enzyme; nickel ion affinity chromatography; enzymatic characteristic

Q815

A

1002-6630（2014）23-0245-04

10.7506/spkx1002-6630-201423047

2014-06-24

徐伟（1963—），女，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。E-mail：xuw@hrbcu.edu.cn