苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式

朱 敏，尹明安，叶红红，任小林

（西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100）

苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式

朱 敏，尹明安*，叶红红，任小林

（西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100）

研究苹果MdACO1基因及转录因子MdHB-1基因在不同器官和不同发育阶段的表达量及其对外源乙烯的反应，以期探讨两基因之间的可能关系。以苹果品种“皇家嘎拉”为试材，利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析不同器官和果实不同发育阶段基因的表达，以及乙烯利处理果实对基因表达的影响。在不同组织器官中，MdHB-1在花瓣中表达量较高，而MdACO1在成熟果中表达量较高。在果实不同发育阶段中MdHB-1在未成熟果中（盛花期40 d后）表达量最高，MdACO1在成熟果中尤其是花后100 d表达量最高。外源乙烯利（500 mg/L）处理的果实放置0～1 d时抑制MdHB-1的表达，但在7 d后其表达量增高；MdACO1表达量在外源乙烯利处理后迅速升高，并随着放置时间的延长而大幅度增高。转录因子MdHB-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控，这一过程似与MdACO1无关。MdACO1参与了果实的成熟过程，但并无受MdHB-1调控的迹象。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达，这一反馈调节过程似与MdHB-1无关。

苹果；ACO基因；转录因子MdHB-1；表达模式；乙烯

作为世界四大水果之一的苹果（Malus pumila Mill.）是呼吸跃变型果实，其成熟衰老过程受内源乙烯的影响极大。如何从分子水平调控苹果果实的乙烯合成，延缓果实成熟衰老，提高其耐贮性，是苹果采后生理和采后分子生物学的一个重要研究方向。而“皇家嘎拉”作为一个品质好又不耐贮运的早熟品种，是人们常用的研究材料。

乙烯通常被称为植物的成熟激素，在植物的种子休眠和萌发、器官的衰老和脱落、性别分化等方面起着重要的作用，同时它还参与植物逆境胁迫响应和细胞程序性死亡等过程[1-3]。在乙烯的生物合成途径中，ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）是关键的限速酶之一，具有重要的调控作用[4-5]。ACO基因的表达与植物器官的成熟、果品保鲜等有密切的关系。因此，研究ACO基因的表达模式，揭示其表达调控途径，有助于调控果实的成熟，阐明乙烯合成的分子机理。在高等植物中，ACO基因的表达受诸如发育、环境和激素信号等因素的调控，并且有时间、组织器官表达特异性[6-7]。已有研究表明，ACO基因的时空表达是受转录因子调控的结果。转录因子通过特异地与ACO基因启动子的顺式作用元件结合，调节基因的表达，间接地调节乙烯的合成，控制植物体内乙烯的水平[8]。Lin Zhefeng等[9]成功克隆到番茄ACO1的转录因子LeHB-1的基因，发现它是HD-Zip亚家族Ⅰ的成员，能与LeACO1启动子结合；病毒诱导沉默LeHB-1的表达有效抑制了LeACO1 mRNA的积累，而且基因的异位过表达导致花器特征的改变以及萼片向果实类似结构的转化。将拟南芥AtHB-1基因在烟草中过表达，发现其对叶片生长发育起到很重要的作用[10]。向日葵HaHB-4在转录水平上受水分状况和ABA的调控，并且还是乙烯信号传递系统的新成员，过表达该基因的转基因拟南芥植株衰老明显延迟，对乙烯也不太敏感；该基因的表达可以明显抑制合成乙烯相关基因如ACO的表达，同时还会抑制乙烯信号传递成员基因ERF2和ERF5的表达[11]。

在苹果中，自第1个ACC氧化酶基因（MdACO1）被克隆到以来[12]，共发现了3 个ACO基因[13]，其中，MdACO1的表达只局限在果实组织中，尤其是在成熟的果实中大量表达，MdACO2则主要在幼嫩果实组织中表达，少量在幼嫩叶片中表达，而MdACO3则主要在幼嫩和成熟叶片中表达，在幼嫩和成熟果实组织中几乎不表达[14]。于巧平等[15]从皇家嘎拉花器官同源克隆得到了一个全长基因MdHB-1，其编码的蛋白含有高度保守的61 个氨基酸的HB结构域，属于HD-Zip转录因子家族成员，同源性分析得知MdHB-1与LeHB-1的同源性极高，但MdHB-1是否调控MdACO1的表达还不得而知。

目前，有关MdHB-1和MdACO1之间的关系还未见研究报道。本研究以“皇家嘎拉”苹果为实验材料，通过研究MdACO1及转录因子MdHB-1在不同器官和不同发育阶段的表达量，揭示其表达模式，同时研究这两个基因对于外源乙烯的响应特点，以期探讨两基因之间的可能关系，为进一步揭示苹果乙烯生物合成的调控机制以及苹果果实成熟的分子机制提供有用信息。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为西北农林科技大学园艺学院园艺场苹果（Malus pumila Mill.）“皇家嘎拉”品种，于2012年4月下旬取幼叶、成熟叶和花器，包括初花期的花蕾和盛花期的花（将花分为雌蕊、花药、萼片和花瓣），并在之后采取不同时期的果实（盛花期后10、40、70、100、110、115、120 d），样品在现场经液氮速冻后置于－70 ℃超低温冰箱中保存以备提取RNA。

另外将采取的花后110 d果实在乙烯利（ethephon，ETH）质量浓度为500 mg/L，体积分数0.02%吐温-20的水溶液中浸泡2 min。对照组：将同样的样品在含0.02%吐温-20的水溶液中浸泡2 min。将处理过后的果实和对照组果实自然风干分别放置0、0.5、1、2、4、7、10、15、21 d。温度20～25 ℃左右，每组做3 次重复，每次重复6 个果实。将上述处理的果实经液氮速冻后放于－70 ℃超低温冰箱进行保存，为提取RNA做准备。

1.2 试剂与仪器

PrimeScript®RT reagent Kit反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ实时荧光定量试剂盒 大连宝生物工程公司；IQ5多重实时荧光定量PCR仪 美国Bio-Rad公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.3 方法

采用宋蓓等[16]的改良十六烷基三甲基溴化铵-氯化锂（hexadecyltrimethyl ammonium bromide-lithium chloride，CTAB-LiCl）法提取“皇家嘎啦”苹果各组织材料总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸蛋白检测仪测定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm以确定RNA的纯度和浓度。

MdHB-1的引物为：F1，5’-GGATTGATGGATC AGGAGAG-3’；R1，5’-GCACCTGGTCAGAA GTGAG-3’，MdACO1的引物为：F1，5’-GACTTGGACT GGGAAAG-3’；R1，5’-CTTCTCCAGTTCCACTGC-3’。苹果内参基因actin的引物为：F1，5’-CATCCAGGCTGTTCT TTCCCTCT-3’；R1，5’-GCCACGCTCAGTC AAAATTTTCA-3’。扩增片段大小为140 bp。反应体系为20 μL，包括10 μL Master预混液，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min后，95 ℃ 10 s→56 ℃ 30 s（荧光检测），35 个循环，后延伸56 ℃ 30 s，设置熔解曲线，以检测引物是否可用。每个基因做3 次重复。反应所使用的仪器为IQ5多重实时荧光定量PCR仪。

数据分析根据Livak等[17]报道的2－ΔΔCt法进行。

2 结果与分析

2.1 MdHB-1和MdACO1在不同组织器官中的表达模式

图1 “皇家嘎拉”苹果不同组织中MdHB-1相对表达量Fig.1 Relative expression levels of MdHB-1 in different tissues of “Royal Gala” apple

由图1可知，MdHB-1在“皇家嘎拉”苹果在叶、花、幼果（盛花期后10 d）等组织中均有表达，表达量从高到低依次为：花瓣、雌蕊、幼叶、萼片、幼果、花药、成熟叶、花蕾、成熟果（盛花期后100 d）。其中，花瓣表达量最高，为雌蕊的1.5 倍；成熟果表达量仅为花瓣的1/16。这表明MdHB-1在幼果组织和花器官中表达量较高，在成熟果实中的表达量较少。

图2 “皇家嘎拉”苹果不同组织中MddACO1相对表达量Fig.2 Relative expression levels of MdACO1 in different tissues of“Royal Gala” apple

由图2可知，MdACO1在花、果实等组织中都有表达，表达量从高到低依次为：成熟果（盛花期后100 d）、花瓣、花药、花蕾、幼果（盛花期后10 d）、萼片、雌蕊、幼叶。成熟果的表达量最高。其中，成熟果表达量为花瓣的10.1 倍；花瓣表达量为幼果的2.2 倍。这表明MdACO1在成熟果实中表达量较高，在幼果及花器官组织中表达量很低，在叶片中几乎不表达。

从图1和图2的比较中可以看出，MdHB-1和MdACO1在各器官中的表达模式并不一致。

2.2 MdHB-1和MdACO1在苹果果实不同发育阶段的表达模式

由图3可知，MdHB-1在盛花期后10 d开始慢慢升高，40 d左右表达量达到最高峰，随后开始下降，从盛花期后70 d到120 d左右表达量依次下降，直到果实完全成熟后表达量降到最低，盛花期后40 d为120 d表达量的79.8 倍。这表明MdHB-1在果实生长发育过程中表达量逐渐减少，在幼果（盛花期后10、40、70 d）中表达量较高，不同成熟阶段果实（盛花期后100、110、115、120 d）中表达量较低。

图3 “皇家嘎拉”苹果果实不同发育阶段中MdHB-1相对表达量Fig.3 Relative expression levels of MdHB-1 in different development stages of “Royal Gala” apple

图4 “皇家嘎拉”苹果果实不同发育阶段中MdAO1相对表达量Fig.4 Relative expression levels of MdACO1 in different development stages of “Royal Gala” apple

由图4可知，MdACO1在盛花期后100 d时表达量达到最高值，前40 d左右表达量非常低，70 d后开始上升，盛花期后100 d为40 d的690.6 倍，110 d左右表达量骤然下降，115 d果实完全成熟后表达量有小幅度下降，120 d表达量又开始上升，是盛花期后40 d的98.4 倍。这表明MdACO1在幼果发育过程中表达量很少或几乎没有，成熟果中尤其是花期100 d表达量很高。

从图3和图4的比较中可以看出，MdHB-1在果实发育前期10～70 d相对表达量很高，在果实成熟及后期阶段100～120 d其相对表达量骤然下降，而MdACO1在果实发育前期10～70 d相对表达量很低，在果实成熟后期100～120 d其相对表达量很高。二者表达模式并不一致。2.3 MdHB-1和MdACO1对外源乙烯处理后的表达特点

图5 乙烯利处理后MdHB-1基因的相对表达量Fig.5 Relative expression level of MdHB-1 gene after ethylene treatment

由图5可知，在“皇家嘎拉”苹果花后110 d的果实中，在0～1 d内，经过乙烯利处理的果实MdHB-1的相对表达量显著低于对照组，说明外源乙烯在0～1 d内抑制了MdHB-1的相对表达量。第2～4天内处理组MdHB-1的相对表达量和对照组基本持平，在7～21 d内，处理组果实MdHB-1的相对表达量高于对照组比并随着时间的增长而增高，在处理21 d后其相对表达量达到最大值，是0 d的5.9 倍。

图6 乙烯利处理后MdACO1基因的相对表达量Fig.6 Relative expression levels of MdACO1 gene after ethylene treatment

由图6可知，经过乙烯利处理的果实MdACO1表达量迅速升高，显著高于对照组的果实，并且MdACO1表达量随着乙烯利处理后放置时间的增长而大幅度增高。21 d后的果实经过乙烯利处理和未经过处理的对照其MdACO1表达量都是最高，并分别是0 d表达量的280.3 倍和122.2 倍。

从图5和图6的比较中可以看出，MdHB-1和MdACO1对外源乙烯的反应表达模式并不一致。

3 讨 论

转录因子（反式作用因子）是一种能同DNA启动子顺式作用元件特异性结合的蛋白质分子，其主要功能是激活或者抑制特定基因的转录[18]。转录因子在基因的表达调控中起重要作用[19]。同源异型盒蛋白就是一类重要的转录因子。该类型转录因子调控与生长发育有关的基因，具有一个高度保守的结构域是其最显著的特征。同源异型-亮氨酸拉链（homeodomain-leueine zipper，HD-Zip）蛋白是植物中所发现的一类转录因子，包含一个高度保守的同源异型结构域（HD）[20]。HD-Zip转录因子的DNA同源结构域与DNA特异结合，Leu zipper（Zip）元件介导蛋白二聚体的形成，二聚体的形成对它们行使功能具有重要意义。转录因子与DNA分子的结合及其二聚化作用很容易受到一些小化学分子的影响，从而它们可以调节转录因子介导的基因表达调控[21-23]。Lin Zhefeng等[9]发现的LeHB-1是模式植物番茄中ACO1的转录因子，其为HD-Zip亚家族Ⅰ的成员。于巧平等[15]发现的苹果转录因子MdHB-1也为HD-Zip家族成员，且在MdACO1启动子部位有其相应的可能结合的顺式作用原件序列。

本研究发现，“皇家嘎拉”苹果中转录因子MdHB-1在雌蕊、花药、花瓣、萼片、未成熟果实中的表达量较高，在果实发育过程中其表达量呈现下降趋势。Lin Zhefeng等[9]的研究发现，模式植物番茄的ACO1基因的转录因子LeHB-1在花芽、衰败花、未成熟果实、绿熟果中表达量较高，但是其mRNA水平在成熟过程中呈现下降趋势，并且在成熟果实中保持相对低的表达水平。LeHB-1在幼叶、成熟叶中也有表达，在花器官中表达量很高，尤其在萼片和雌蕊。本研究得到的结果与Lin Zhefeng等[9]的研究结果是基本一致的。

本研究进一步发现，“皇家嘎拉”苹果中，MdACO1在花、果实等组织中都有表达，表达量最高的是成熟果，其次是是花瓣，在幼叶和成熟叶中几乎不表达；在不同发育阶段的果实中，MdACO1在幼果中表达量很少或几乎没有，而在成熟果中尤其是盛花期后100 d果实中表达量很高。Binnie等[14]的相关研究表明：MdACO1基因主要是在苹果的成熟果中表达，而在幼果中其表达量很少，在苹果叶子中几乎检测不到其有表达。对比发现，苹果MdACO1基因与番茄LeACO1、LeACO4，桃子PpACO1等基因的表达形式相似，再次证明了MdACO1是与果实成熟有关的基因。由于本实验中MdACO1在幼叶和成熟叶中的表达量均几乎为零，所以同样可以推测该基因对苹果功能叶的作用非常小。

Lin Zhefeng等[9]的研究发现，在番茄果实转色期第7天，通过病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）方法使LeHB-1基因沉默，LeHB-1基因64%～90%被沉默，会引起LeACO1表达量80%～86%的降低。他们认为转录因子LeHB-1不仅调控番茄ACO1的转录，也调控着番茄果实成熟。LeHB-1编码一级HD-Zip蛋白质，并且与LeACO1的启动子结合，LeHB-1基因的沉默使得LeACO1 mRNA水平也降低，从而抑制LeACO1的表达来延缓果实成熟。LeHB-1在绿熟期果中表达量比较高，破色期开始降低[9]，然而LeACO1 mRNA水平在绿熟期果中开始增加，并且在果实成熟过程中其积累量在逐渐升高[24]。

转录因子MdHB-1基因与MdACO1基因在各器官和不同发育阶段果实中的表达模式（或者说表达谱）并不一致的事实说明，MdHB-1作为转录因子可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控，但此过程似与MdACO1无关。MdACO1参了果实的成熟过程，但并无受MdHB-1调控的迹象。本实验的研究结果与Lin Zhefeng等[9]的研究结果有些出入，其原因可能由于番茄是茄科茄属植物，其果实为浆果，而苹果是蔷薇科苹果属植物，果实为仁果类，二者在分类学和组织学上均存在着很大的差异。

许多情况下，基因表达和mRNA丰度的变化是由激素和信息传递来调控的。Yang Xiaotang等[25]认为在苹果果实中乙烯相关基因的表达变化与乙烯调控果实成熟变化是一致的，他们根据表达模式获知，ACO基因与乙烯的生成紧密相关，ACO1是苹果果实中乙烯生物合成的主要因素。在反义ACO1转基因株系中，抑制ACO1可以使乙烯合成水平明显降低[26]。本研究发现，乙烯利处理后0～1 d内MdHB-1的表达水平显著低于对照组，说明外源乙烯在这段时间内抑制了其表达水平；7 d以后MdHB-1的表达水平才开始逐渐上升并随着时间增长而相应提高。而MdACO1在乙烯利处理之后表达量迅速增加，且日益增高。MdHB-1和MdACO1对外源乙烯的反应并不一致。外源乙烯通过反馈调节系统促使MdACO1表达量增加，这一过程似与MdHB-1无关。

本实验依据MdHB-1和MdACO1在基因表达上的时空相关性对该二者之间的关系进行了初步探讨，由于研究方法的局限性和生命科学的复杂性，研究结果还有待于借助其他研究手段的进一步证实或修正。因为MdHB-1基本定性为转录因子，而在MdACO1启动子部位有其相应的可能结合的顺式作用原件序列，加之模式作物番茄的研究结果，二者之间可能的调控关系只有经过多方面的实验研究才能最终否定或肯定。研究二者结合作用的研究方法有电泳迁移率检测（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）、酵母单杂交、染色质免疫沉淀技术等，研究二者是否有上下游调控关系的研究方法包括VIGS及反义RNA、RNAi、超表达等转基因技术。

Zheng Qifa等[27]研究结果表明为了调控果实成熟和响应乙烯处理有一个动态的蛋白网络机制来识别蛋白的显著变化。除此之外，通过乙烯的处理可以诱导出在一些未经处理的成熟果实中未曾出现的一系列特定蛋白。他们发现这些特定蛋白的产生在苹果果实成熟阶段可以显著影响抗氧化还原系统、乙烯的生物合成、防御机制、初级和次级代谢活动。所以今后进一步的研究应该包括有针对性地开发和应用定量蛋白质组学方法来研究负责果实成熟和衰老的目标蛋白。如本实验中通过乙烯的处理可能诱导出现一些特定蛋白，这些特定蛋白的出现可能使MdACO1 mRNA表达量大幅度上升。

4 结 论

转录因子MdHB-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控，这一过程似与MdACO1无关。MdACO1参了果实的成熟过程，但并无受MdHB-1调控的迹象。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达，这一反馈调节过程似与MdHB-1无关。该结论有待于其他研究手段的进一步证实或修正。

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Expression Patterns of ACO1 Gene and Transcription Factor MdHB-1 in Apple

ZHU Min, YIN Ming-an*, YE Hong-hong, REN Xiao-lin
(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this study, we investigated the expression patterns of the MdACO1 gene and its transcription factor MdHB-1 in different organs at different developmental stages in apple, as well as their response to exogenous ethylene treatment, with the purpose to reveal the relationship between these genes. The expression levels of MdACO1 and MdHB-1 in apple cultivar “Royal Gala” were detected in different organs at different fruit development stages, also under exogenous ethylene treatment by real-time quantitative PCR. Results showed that in different organs, MdHB-1 showed relatively higher expression level in petal, while MdACO1 exhibited relatively high expression level in mature flesh. At the different stages of fruit development, MdHB-1 gene was expressed highest in young flesh (about 40 days after the full flowering stage), but MdACO1 gene exhihibited the highest expression level in mature fruits, specifically at 100 days after the full flowering stage). Under exogenous ethylene treatment, the expression of MdHB-1 was inhibited in the fruits stored for 0-1 d, but its expression level increased after 7 d storage, while the expression level of MdACO1 gene increased rapidly with the extension of time. These results suggested that MdHB-1 may be involved in the regulation network of gene expression in young apple fruits and floral organs, while MdACO1 was not involved in these processes. The MdACO1 gene played an important role in the maturation of apple fruits, which was not regulated by MdHB-1. In addition, exogenous ethylene could induce the high expression of MdACO1 in “Royal Gala”, while MdHB-1 did not participate in this feedback regulation process.

apple; ACO gene; transcription factor MdHB-1; expression patterns; ethylene

S661.1

A

1002-6630（2014）23-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201423033

2014-01-08

国家现代农业（苹果）产业技术体系建设专项（nycytx08-05-02）

朱敏（1989—），女，硕士研究生，研究方向为果蔬采后生理及分子生物学。E-mail：zhumin2008happy@163.com

*通信作者：尹明安（1956—），男，教授，博士，研究方向为果蔬采后生理及分子生物学。E-mail：yinma22@163.com