应用前沿亲和色谱 评价5 种知母糖苷类化合物的α-淀粉酶抑制活性

胡园园，郭 辉，钱俊青

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014）

应用前沿亲和色谱 评价5 种知母糖苷类化合物的α-淀粉酶抑制活性

胡园园，郭 辉，钱俊青*

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014）

以硅胶为载体，制备α-淀粉酶亲和色谱柱，以线扫循环伏安法为检测方法，评价知母提取物的α-淀粉酶抑制活性。首先考察固定化条件对固定化酶的影响以及亲和色谱柱的稳定性。其次利用前沿亲和色谱检测5 种知母糖苷类化合物（新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ）的α-淀粉酶亲和力。最后检测化合物的α-淀粉酶抑制活性。结果表明5 种化合物的α-淀粉酶结合力大小排序为：新芒果苷（Kd=0.230 5 μmol/L）＞芒果苷（Kd=0.299 5 μmol/L）＞知母皂苷BⅡ（Kd=0.312 4 μmol/L）＞知母皂苷BⅢ （Kd=0.316 2 μmol/L）＞知母皂苷AⅡ（Kd=0.453 3 μmol/L），其排序结果与样品的α-淀粉酶抑制活性一致。说明前沿亲和色谱可以用来定量检测化合物的α-淀粉酶抑制活性，且可根据亲和力的大小将化合物的抑制活性进行排序。

前沿亲和色谱；线扫循环伏安法；固定化α-淀粉酶；α-淀粉酶抑制活性；知母

α-淀粉酶抑制活性可以用来评价化合物的降糖活性[1]，以α-淀粉酶为标靶制备亲和色谱柱，可以提高降糖药物的筛选效率[2]。前沿亲和色谱（frontal affinity chromatography，FAC）[3-4]通过将标靶分子固定在载体上制备亲和色谱柱，待测样品溶液通过亲和色谱柱，样品溶液中与固定化分子有生物亲和性的化合物就会与固定化分子结合，使其流出滞后，流出体积增大。亲和力越大的化合物，结合力越大，流出体积就越大，通过合适的检测器就可得相应的流出曲线，并计算得出解离常数Kd[5]。目前这种方法已经被广泛用来定量分析受体-配体[6-7]，酶-底物和酶-抑制剂[8]等。本实验采用硅胶吸附[9]固定化α-淀粉酶，其条件 温和，对酶的稳定性和活性影响小[10]。

前沿亲和色谱的检测方法有很多种，根据化合物的特性及检测目的不同可灵活选择不同的检测器。紫外检测器操作简便、成本低，适用于已知的、有紫外吸收特性的化合物的Kd的检测。质谱检测器[3]成本高、操作复杂，但可用于未知化合物的Kd值的检测及其化学结构和结合位点的确定。极谱检测[11-12]方法简单、灵敏度高、快速准确、选择性好、应用范围广，可用于紫外可见光波长范围内吸收弱或者没有紫外吸收的化合物的Kd值检测[13]。本实验待检测样品新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ为知母提取物，其中3 个知母皂苷类的化合物紫外吸收弱，但是有电化学活性基团（碳碳共轭双键、羰基、羟基等），所以选择极谱分析仪作为检测器。本实验将前沿亲和色谱与线扫循环伏安法结合用来定量分析分子间亲和力，它可以作为亲和色谱紫外检测的一种补充，扩大亲和色谱筛选应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ，由浙江工业大学生药学实验室提供，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测纯度大于97%。

硅胶（100～200 目） 青岛海洋化工厂分厂；3,5-二硝基水杨酸、石墨粉 国药集团化学试剂有限公司；α-淀粉酶（猪胰蛋白酶） 上海楷洋生物技术有限公司；阿卡波糖（50 mg/片） 拜耳医药保健公司；可溶性淀粉 天津光复精细化工研究所；氢氧化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、可溶性淀粉、酒石酸钾钠等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JP-303极谱分析仪 成都仪器厂；工作电极为石墨电极、参比电极为饱和Ag-AgCl电极、对电极为铂片电极 天津兰力科化学电子高技术有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；SHA-BA水浴恒温振荡器 上海荣华仪器有限公司；HIMAC CR21GII 高速冷冻离心机 日本日立工机株式会社。

1.3 方法

1.3.1 α-淀粉酶固定化

α-淀粉酶固定化方法采用物理吸附法[9]，准确称取1.5 g硅胶，加入15 mL α-淀粉酶（10 mg/mL）溶液，密封于37 ℃水浴170 r/min振荡12 h。离心分离，用缓冲液洗涤固体，再离心分离，如此反复至洗涤液在280 nm波长处检测不到吸收值为止，检测固定化酶的表观酶活力和固定化蛋白含量。

1.3.2 固定化α-淀粉酶活力测定

固定化α-淀粉酶酶活力测定参照Bernfeld法[14]。取20 μL固定化酶（0.1 mg/mL）溶液与200 μL的磷酸缓冲液（pH 7.0）混合放入5 mL容量瓶中，置于60 ℃恒温水浴振荡10 min，然后加入200 μL 1%淀粉溶液准确反应10 min，然后加入200 μL 3,5-二硝基水杨酸，在沸水浴中加热煮沸10 min停止反应，流水冷却，定容到5 mL，摇匀后于520 nm波长处测定吸光度。同时设置空白对照组，以麦芽糖为标准曲线测出酶活力。

固定化α-淀粉酶活力单位定义为：在上述条件下α-淀粉酶每分钟水解生成1 μmol麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

固定化表观酶活力测定：固定化的硅胶用缓冲溶液冲洗，直至洗脱液在280 nm波长处无吸收值，测定固定化硅胶的α-淀粉酶酶活力，按照公式（1）计算固定化表观酶活力回收率。

1.3.3 固定化蛋白含量测定方法

参照Bradford 法[15-16]，0.1 mL蛋白洗脱液加入5 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，2 min内，在595 nm波长处检测，记录吸光度，以牛血清白蛋白为标准蛋白曲线计算蛋白含量，并按照公式（2）计算酶固定化率。

1.3.4 α-淀粉酶抑制活性的测定方法

α-淀粉酶抑制活性的测定方法参照Bernfeld法[17]，样品先用少量二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，然后用重蒸水稀释到相应的浓度，以1%可溶性淀粉为底物，测定了这5 种化合物对α-淀粉酶的抑制活性，以Acarbose半抑制浓度（IC50）为阳性对照。

1.3.5 前沿亲和色谱-线扫循环伏安法检测样品与α-淀粉酶的亲和力

亲和色谱柱的制备：将固定化硅胶用湿法装柱填充到层析柱（20 cm×0.5 cm）中，边装柱边敲，使硅胶填充紧密。用0.05 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.0）冲洗柱子，直至出现缓冲溶液峰。

检测池为两边不等高的U型圆柱型腔室，在短端上连接一个独立腔室，中间放置两层环形硅胶环，加强密封效果，硅胶垫中间夹入一层磺化聚砜膜（使用前在1.0×10－2mol/L的H2SO4中浸泡8 h以上，使用前用超纯水洗净），以1.0×10－3mol/L的KCl为电解质[18]。

样品溶液配制成几个不同的浓度。进样之前，先对样品溶液进行CV扫描，扫描速率100 mV/s，找出最佳扫描电压范围。然后在最佳电压扫描范围内，将样品溶液加在亲和硅胶色谱柱上，记录开始时间、流速，直到出现样品溶液峰，记录结束时间。在一个样品检测结束后，通入淋洗液，吸收峰再次平衡后，可以进行下一个样品的检测。

苯酚的流出体积（V0）作为空白对照，0.01 mg/mL苯酚溶液的流出体积为0.4 mL，阿卡波糖为阳性对照。各样品先溶于少量DMSO溶液中，然后用双蒸水配制成不同浓度后通入亲和色谱柱，通过极谱分析仪，得到各浓度样品的流出体积，计算酶与样品的解离常数Kd。

1.3.6 前沿亲和力计算方法

根据前沿亲和色谱理论，前沿亲和色谱的基本平衡方程为式（3）[5]。

式中：Kd为A、B分子的解离常数/（μmol/L）；A为待测化合物；B为固定化酶；[A]0是待测化合物A进入亲和柱中的初始浓度/（μmol/L）；Bt是亲和色谱柱中固定化酶量/nmol；V为化合物A的洗脱体积/mL；V0为死体积/mL。

为了求得A、B分子的解离常数Kd，可将方程（3）变形后得到下式（4）。

1.3.7 亲和色谱柱的稳定性评价

将质量浓度为0.1 mg/mL的芒果苷重复进样，检测α-淀粉酶亲和色谱柱的使用稳定性，包括日内重复使用稳定性和日间的重复使用稳定性。

2 结果与分析

2.1 硅胶吸附固定α-淀粉酶的工艺优化

不同固定化条件对固定化酶的影响很大。由表1可知，加酶量影响载体上固定化酶的量。随着加酶量的增加，表观酶活力回收率和酶固定化率也增加，当加酶量为150 mg时，表观酶活力回收率为（63.44±0.04）%，酶固定化率为（59.96±0.03）%，都达到了最佳值。这是因为在一定数量的载体基团的条件下，溶液中游离酶量越多，能固定上去的酶也越多，酶固定化率越高。当游离酶量与载体可吸附基团平衡时，继续增加酶量，空间位阻增大，影响游离酶与活性基团的吸附，使表观酶活力回收率和酶固定化率降低。

表1 不同固定化条件对固定化酶的影响Table1 Effect of different immobilization conditions on the immobilized enzyme

pH值影响游离酶的活性，对酶的活性中心的形成有重要作用。不同pH值环境对酶的固定化影响也很大，在最适pH 7.0的磷酸缓冲液中，酶的表观酶活力回收率（66.87±0.03）%和酶固定化率（66.21±0.05）%都到了最大值，偏酸或偏碱都不利于酶的固定化。吸附温度、吸附时间也会影响酶的表观酶活力回收率和酶固定化率，由表1可知，最佳吸附温度和最佳吸附时间分别是40 ℃和12 h。1.5 g硅胶加入15 mL α-淀粉酶（10 mg/mL）溶液中（pH 7.0的磷酸盐缓冲液溶解）在40 ℃的恒温水浴锅中170 r/min吸附12 h，表观酶活力回 收率和酶固定化率分别为（81.02±0.06）%和（67.45±0.01）%。

2.2 亲和色谱柱的稳定性

表2 亲和色谱柱的日内重复使用性Table2 Repeatability of the affinity column performed in one day

表2是在同一根亲和色谱柱上一天内连续进样5 次所得突破体积（V－V0），由表2可知，连续5 次进样的平均突破体积为0.59 mL，其日内重复性非常好（相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）＜3%）。

表3 亲和色谱柱的日间重复使用性Table3 Reproducibility of the affinity column performed in 5 days

表3为亲和色谱柱的日间的重复使用稳定性，在同一根亲和色谱柱上连续5 d每天进样1 次测其流出曲线，5 d的平均突破体积为0.60 mL，日间重复性的RSD为6.79%。结果表明，随着使用时间的延长，其重现性有所下降。但在4 d内其RSD＜5%，从而得知亲和色谱柱可 以重复使用4 d左右。

2.3 前沿亲和色谱-线扫循环伏安法检测样品与α-淀粉酶的亲和力

表4 样品前沿亲和色谱的Kd值Table4 Determination of kd for samples in the affinity column

由表4可知，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅡ的Kd值分别是0.230 5、0.299 5、0.312 4、0.316 2、0.453 3 μmol/L。Kd值越小，化合物与标靶酶的亲和力越大。根据样品化合物Kd值将化合物与α-淀粉酶的亲和力排序，其结合力大小是：新芒果苷＞芒果苷＞知母皂苷BⅡ＞知母皂苷BⅢ＞知母皂苷AⅡ。

2.4 样品的α-淀粉酶抑制活性

为了进一步确定样品对α-淀粉酶的亲和力与其对α-淀粉酶作用的关系，测定了5 种化合物的α-淀粉酶抑制活性。

表5 样品的α-淀粉酶抑制活性Table5 a-Amylase inhibitory activity of samples

由表5可知，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅡ的IC50分别是（22.24±0.03）、（41.60±0.30）、（43.36±0.50）、（52.87±0.7）、（196.63±0.70）mg/mL。样品的α-淀粉酶抑制活性：新芒果苷＞芒果苷＞知母皂苷BⅡ＞知母皂苷BⅢ＞知母皂苷AⅡ。

由以上结果可知化合物的α-淀粉酶结合力大小与其α-淀粉酶抑制活性呈正相关。说明前沿亲和色谱-线扫循环伏安法可以用来评价天然化合物的α-淀粉酶抑制活性。

3 结 论

以硅胶为载体，制备α-淀粉酶亲和色谱柱，以线扫循环伏安法为检测方法，应用前沿亲和色谱技术评价5 种知母糖苷类化合物的α-淀粉酶抑制活性。通过定量检测化合物与固定化酶的亲和性，再根据结合力大小排序，结果表明前沿亲和色谱可以用来评价化合物的抑制活性。线扫循环伏安法设备价廉，操作简便，灵敏度高可用于紫外吸收弱或没有紫外吸收的化合物的检测，将前沿亲和色谱与线扫循环伏安法联用扩大了前沿亲和色谱的应用范围。为了使前沿亲和色谱技术更好地应用于天然化合物的筛选，要不断地丰富和完善亲和色谱柱的制备和检测器的运用。

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Application of Frontal Affinity Chromatography for Evaluating α-Amylase Inhibitory Activity of Five Glycoside Compounds Extracted from Rhizoma anemarrhenae

HU Yuan-yuan, GUO Hui, QIAN Jun-qing*
(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Silica gel was used as the carrier to prepare α-amylase affinity chromatography column. The column was then used for evaluating the α-amylase inhibitory activity of five glycoside compounds (neomangiferin, mangiferin, timosaponin AⅡ, timosaponin BⅡ, and timosaponin BⅢ) from Rhizoma anemarrhenae by linear scan cyclic voltammetry. The effect of immobilization conditions on the immobilized enzyme and the stability of the affinity chromatography column were investigated. Frontal affinity chromatography was applied to explore the binding affinity of these five glycoside compounds to α-amylase. Finally, the α-amylase inhibitory activity of samples was assayed. Results showed that the α-amylase binding affinity of the glycosides followed the decreasing order: neomangiferin (Kd= 0.230 5 μmol/L) ＞ mangiferin (Kd= 0.299 5 μmol/L) ＞ timosaponin BⅡ (Kd= 0.312 4 μmol/L) ＞ timosaponin BⅢ (Kd= 0.316 2 μmol/L) ＞ timosaponin AⅡ (Kd= 0.453 3 μmol/L). The same ranking was observed for α-amylase inhibitory activity. Therefore, frontal affinity chromatography can be used to quantitatively detect the α-amylase inhibitory activity of five glycoside compounds and the α-amylase inhibitory activity follows the same order as the binding affinity.

frontal affinity chromatography; linear scan cyclic voltammetry; α-amylase immobilization; α-amylase inhibitory activity; Rhizoma anemarrhenae

R932

A

1002-6630（2014）23-0099-05

10.7506/spkx1002-6630-201423020

2014-02-21

浙江省科技创新团队重大科技项目（2010R50032）

胡园园（1988—），女，硕士研究生，主要从事前沿亲和色谱筛选中药降糖药研究。E-mail：zhiyao0701@163.com

*通信作者：钱俊青（1964—），男，教授，博士，主要从事天然药物分离研究。E-mail：pharmo@163.com