散瘀和胃汤对大鼠胃癌前病变的影响研究

孙晓娜，汪 伟，张玉峰，吴秋霞，党中勤，牛学恩

胃癌前病变(precancerous lesions of gastric canner，PLGC)是包括慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)并伴有肠上皮化生(Intestinal metaplasia，IM)和不典型增生(atypical hyperplasia，ATP)的一种病理状态。多项研究表明CAG伴IM和ATP与胃癌(gastric cancer，GC)的发病呈正相关，因此PLGC与GC的发生密切相关。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由20～25个核苷酸构成的单链非编码RNA分子，在肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要角色[1]，已成为当前肿瘤研究的热点之一。let-7a是较早发现的miRNA之一，研究显示其与人类众多肿瘤的发生、发展相关，与胃癌的生物学特性也存在密切关系[2]。本研究通过探讨散瘀和胃汤对PLGC let-7a的影响，为中药治疗PLGC提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择清洁级Wistar大鼠60只，雄性，体质量200～220 g，由河南中医学院实验动物中心提供。采用随机数表法分为对照组(11只，空白对照)和造模组(49只)。

1.1.2 主要试剂 散瘀和胃汤由茵陈15 g、藿香15 g、佩兰15 g、茯苓18 g、黄连6 g、半枝莲20 g、半边莲20 g、全蝎3 g、白花蛇舌草25 g、丹参15 g组成，药材购自河南省中医院中药房，按1∶5比例加水浸泡30 min，煮沸30 min，过滤。药渣再次按1∶5比例加水煮沸20 min，过滤并合并2次药液，60 ℃水浴，浓缩成1 ml相当于原生药材1 g的药液，于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组 所有大鼠食用颗粒性饲料，饮用自来水，适应性喂养1周后，采用限期饮水给药法建立大鼠PLGC模型，对照组给予正常饮食，造模组每日将新鲜配制浓度为100 g/L的甲基硝基亚硝基胍(MNNG)饮用液供大鼠饮用，连续24周，并随机抽取5只大鼠做病理学检测以确定造模情况，造模成功后随机分为模型组、散瘀和胃汤高剂量治疗组(11.50 g·kg-1·d-1，高剂量组)、散瘀和胃汤中剂量治疗组(5.55 g·kg-1·d-1，中剂量组)、散瘀和胃汤低剂量治疗组(2.75 g·kg-1·d-1，低剂量组)，每组11只。第12周末处死各组大鼠，选取同一部位将胃沿大弯侧打开，光镜下观察胃黏膜病理组织学改变，计数各组浅表性胃炎(CSG)、CAG、IM、ATP的发生情况，其中CAG+IM和CAG+ATP均属于PLGC。

1.2.2 仪器与试剂 荧光定量PCR仪为美国ABI公司的ABI7000；反转录引物参照Caifu Chen等进行设计，荧光PCR引物及探针使用Primer Express软件(ABI)设计，标准品(let-7aSeq)为人工合成let-7a miRNA模板。核酸合成均在上海基康生物技术有限公司进行。Super ScriptⅡ反转录酶购自Invitrogen公司，其他PCR试剂均为Promega公司产品。

1.2.3 基因检测

1.2.3.1 总RNA提取 胃癌组织及相应正常胃黏膜组织总RNA提取采用TRIzol试剂；严格按照说明书进行操作。提取的总RNA应用紫外分光光度计、根据A260进行定量。将正常胃黏膜组织总RNA定量至5 μg，然后依次稀释至500.000、50.000、5.000、0.500、0.050、0.005 ng共7个梯度。

1.2.3.2 反转录反应 10 μl总RNA或人工合成let-7a miRNA模板于70 ℃变性10 min后立即冰浴；加入50 ng/μl反转录引物let-7a PRT 1.0 μl，10 mmol/L dNTP 1.0 μl，5×RT buffer 4.0 μl，Super ScriptⅡ反转录酶1.0 μl，反应体系为20 μl，室温10 min，42 ℃保温45 min，85 ℃保温5 min，4 ℃保温5 min。

1.2.3.3 PCR 取上述反转录产物5.0 μl，按以下体系进行PCR扩增:5.0 μl 10×PCR buffer，5.0 μl 25 mmol/L Mg2+，1.0 μl 10 mmol/L dNTP，上下游引物(let-7aP，f let-7aPr)各50 pmol，MGB探针(let-7aT)10.0 pmol，5 U/μl Taq酶1.0 μl，反应体系为50 μl，循环条件为94 ℃预变性10 min、94 ℃变性15 s、62 ℃退火1 min，扩增40个循环后观察分析结果。

2 结果

2.1 let-7a相对表达量比较 各组的let-7a相对表达量分别为：对照组(0.626±0.102)、模型组(0.291±0.097)、低剂量组(0.326±0.108)、中剂量组(0.494±0.144)、高剂量组(0.623±0.098)，各组间差异有统计学意义(F=22.377，P=0.001)。其中对照组let-7a相对表达量较模型组、低剂量组、中剂量组高，差异有统计学意义(t=7.857、6.706、2.457，P<0.05)；模型组较中剂量组、高剂量组低，差异有统计学意义(t=-3.854、-7.959，P<0.01)；低剂量组较中剂量组、高剂量组低，差异有统计学意义(t=-3.101、-6.777，P<0.01)；中剂量组较高剂量组低，差异有统计学意义(t=-2.452，P<0.05)。

2.2 光镜下各组胃黏膜病理组织学改变情况及PLGC发生率比较 各组CSG、CAG、CAG伴IM、CAG伴ATP的发生例数详见表1，其中后两项属于PLGC。各组PLGC发生率比较，差异有统计学意义(χ2=21.734，P=0.000)。其中模型组PLGC发生率较中剂量组和高剂量组高，差异有统计学意义(χ2=7.90，P<0.05；χ2=10.29，P<0.05)。

表1 光镜下各组胃黏膜病理组织学改变情况及PLGC发生率比较

Table1 Comparison of histopathological change of gastric mucosa and the incidence rate of PLGC in each group

组别只数CSGCAGCAG+IMCAG+ATPPLGC发生率对照组11110000模型组11015510/11低剂量组1122437/11中剂量组1152224/11高剂量组1162213/11

注：CSG=浅表性胃炎，CAG=慢性萎缩性胃炎，CAG+IM=慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生，CAG+ATP=慢性萎缩性胃炎伴不典型增生，PLGC=胃癌前病变

3 讨论

CAG是最常见的胃癌前状态，Sipponen等[3]证实了50%～90%的胃癌患者伴有CAG，CAG演变成胃癌的发生率约为10%。CAG的主要病理特征为黏膜慢性炎症和腺体萎缩，CAG伴有胃黏膜IM和ATP定义为PLGC。国内外许多研究者致力于寻找延缓和逆转腺体萎缩、肠化、异性增生的方法，但未取得突破性进展。中医药具有辨证论治、个体化、方药随证加减等特点，为治疗CAG及PLGC积累了许多经验。

PLGC多因先天脾胃虚弱，长期、反复的饮食不节，情志所伤，外邪犯胃，导致气机郁滞、脾失健运，湿热内阻、热毒蕴结、瘀血停滞、阴液亏虚，而热毒和血瘀是本病病机演变所在。“毒为热之极，热为毒之渐”。阴伤源于热毒，气滞日久必见血瘀。有学者采用散瘀和胃汤辨证加减治疗CAG伴IM患者52例，总有效率94%，能明显改善胃黏膜充血、糜烂、白象、粗糙，逆转胃黏膜萎缩和肠化[4]。散瘀和胃汤方中藿香、丹参，散瘀和胃，为君药，《本草图经》谓藿香“治脾胃吐逆，为最要之药”。臣以佩兰、茯苓化湿和胃，和中定痛，活血化瘀。以茵陈、半枝莲、白花蛇舌草、黄连清热解毒散瘀共为佐使。全蝎攻毒散结，通络止痛，诸药合用共奏化浊解毒、活血化瘀之功。现代药物研究表明，藿香可抑制肠管痉挛性收缩及内脏绞痛，增加胃酸分泌，提高胃蛋白酶活性，调节免疫力[5]。佩兰[6]、茯苓[7]具有增强免疫力、抗感染及抗肿瘤作用。茵陈[8]、黄连[9]、白花蛇舌草[10]、半枝莲[11]、半边莲[12]具有良好的抑制肿瘤细胞作用。丹参能够改善血液微循环，促进组织修复与再生，具有抗感染及抗肿瘤作用[13]。

miRNA是一类由20～25个核苷酸构成的单链非编码RNA分子，具有调节肿瘤发生与发展的功能[1]，并与对化放疗的敏感性[14]、复发率[15]及耐药[16]等密切相关。miRNA与肿瘤关系的研究成为当前肿瘤研究的热点之一，最近对胃癌的研究发现，部分miRNA与胃癌的生物学特性存在密切关系。Chan等[17]用RT-PCR技术对37例胃癌组织与正常组织中的miR-21的表达水平进行定量分析，探讨miR-21与临床病理因素间的相关性，结果显示miR-21在胃癌组织中过度表达，但与胃癌患者的预后无明显相关性。Zhang等[18]在细胞研究中证实了miR-21的过度表达能够促使细胞增殖、移动和停止细胞凋亡。通常认为胃癌的传统发生途径为：CSG→CAG→IM→ATP→胃癌。在与胃黏膜炎症、PLGC和胃癌有关的miRNAs微点阵分析中，Petrocca等[19]发现了具有正向调节作用的miR-106b、miR-25和miR-93，证实了miR-106b、miR-25和miR-93改变胃癌细胞对TGF-β的生理应答，影响了细胞周期和细胞凋亡。Xiao等[20]认为miR-155在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞及胃黏膜组织中表达增多，miR-155的过度表达负向调节IL-8释放和增殖相关的癌基因SMAD2(Sma and Mad-related protein 2)，miR-155的过度表达明显减少了幽门螺杆菌感染所引起的IL-8的产生，证实miR-155通过靶向调节炎症途径中的关键分子MyD88而负向调节炎性反应，而笔者未见散瘀和胃汤对PLGC let-7a影响的相关研究文献。

本研究通过对癌前病变大鼠胃黏膜组织miRNA进行检测，观察活血散瘀汤对PLGC大鼠胃黏膜组织let-7a的影响，研究结果显示，let-7a在PLGC中呈低表达。中、高剂量散瘀和胃汤能够提高let-7a的表达量，并且减少PLGC发生率，因此散瘀和胃汤可能通过增高胃黏膜组织miRNA的表达量而防止癌变。今后将进一步通过免疫组化及western blot等技术验证let-7a相关蛋白的表达情况，为确定let-7a在胃癌中的靶向调控机制提供研究基础，为利用散瘀和胃汤治疗CAG及PLGC提供更加充分的理论依据。

1 Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V,et al.The C.elegans hetero chronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-4[J].Cell，1993，75(5)：843-854.

2 Zhang HH，Wang XJ，Li GX，et al.Detection of let-7a microRNA by real-time PCR in gastric carcinoma[J].World J Gastroenterol，2007，13(20)：2883-2888.

3 Sipponen P，Harkonen M，Alanko A，et al.Diagnosis of atrophic gastritis from a serum sample[J].Minerva Gastroenterol Dietol，2003，49(1)：11-21.

4 王彦刚，李佃贵.基于浊毒学说治疗慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生临床疗效观察[J].中华中医药杂志，2009，24(3)：353-355.

5 刘红淼，李艳玲，杨继章.广藿香油的药理作用研究进展[J].中国药房，23(47)：4056-4057.

6 魏道智，宁书菊，林文雄.佩兰的研究进展[J].时珍国医国药，2007，18(7)：1782-1783.

7 梁学清，李丹丹，黄忠威.茯苓药理作用研究进展[J].河南科技大学学报，2012，30(2)：154-156.

8 华永庆，洪敏，陈文星.茵陈蒿汤肝细胞结合成分对肿瘤细胞的影响[J].中国药理与临床，2010，26(6)：1-2.

9 刘刚，陈念平.黄连素抗癌特性的研究进展[J].广东医学院学报，2012，30(2)：210-212.

10 张鹏，赵启韬，杨培民，等.白花蛇舌草核苷体外抗肿瘤作用实验研究[J].时珍国医国药，2012，23(8)：1901-1902.

11 宋高臣，于英君，王喜军.半枝莲多糖的抗肿瘤作用及其调节免疫的实验研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2011，13(4)：641-643.

12 粟君，谭兴，李劲涛，等.半边莲生物碱的提取及其对胃癌细胞的抑制作用[J].西华师范大学学报，2007，28(4)：84-86.

13 何根云.丹参的药理作用与临床应用[J].浙江中西医结合杂志，2011，21(2)：124-125.

14 Bandres E，Bitarte N，Arias F，et al.microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clin Cancer Res，2009，15(7)：2281-2290.

15 Tsai KW，Liao YL，Wu CW，et al.Aberrant expression of miR-196a in gastric cancers and correlation with recurrence[J].Genes Chromosomes Cancer，2012，51(4)：394-401.

16 Wang XY，Xu MH，Liu F，et al.Differential miRNA expression and their target genes between NGX6-positive and negative colon cancer cells[J].Mol Cell Biochem，2010，345(1-2)：283-290.

17 Chan SH，Wu CW，Li AF，et al.miR-21 microRNA expression in human gastric carcinomas and its clinical association[J].Anticancer Res，2008，28(2)：907-911.

18 Zhang Z，Li Z，Gao C，et al.miR-21 plays a pivotal role in gastric cancer pathogenesis and progression [J].Lab Invest，2008，88(12)：1358-1366.

19 Petrocca F，Visone R，Onelli MR，et al.E2F1-regulated microRNAs impair TGFβ-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer[J].Cancer Cell，2008，13(3)：272-286.

20 Xiao B，Liu Z，Li BS，et al.Induction of microRNA-155 during Helicobacter pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory response[J].J Infect Dis，2009，200(6)：916-925.