特应性皮炎患儿外周血巨噬细胞游走抑制因子及IL-17和IL-23的表达及其相关性研究

马 蕾，高梅兰，薛海波，管秀好，舒春梅，张桂芹，运蓓蕾

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年4—11月在我院门诊就诊的36例AD患儿为病例组，其中男20例，女16例；年龄3～16岁，平均(9.9±3.7)岁；采用疾病的严重程度(SCORAD)评分[4]评价患儿疾病严重程度：中度26例(15分≤SCORAD评分<40分)，重度10例(SCORAD评分≥40分)；所有患儿于入组前1周停用抗组胺药、外用糖皮质激素、免疫调节剂及免疫抑制剂，且6个月内未系统使用糖皮质激素及免疫相关制剂。选择同期在我院体检正常儿33例为对照组，其中男17例，女16例；年龄5～16岁，平均(10.8±3.2)岁。两组受试者性别、年龄比较，差异均无统计学意义(χ2=0.113,t=1.144,P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会审核通过，并由患儿监护人签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs的分离 所有受试者于8：00～9：00采集空腹外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，聚蔗糖(Ficoll)(ρ=1.077)密度梯度离心法分离PBMCs。

1.2.2 PBMCs中MIF、IL-17及IL-23 mRNA的表达 采用实时定量RT-PCR，Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)提取PBMCs总RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度，吸光度值(A260/A280)介于1.8～2.0，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性；采用PrimeScriptTMRT反转录试剂盒(TaKaRa，宝生物工程大连有限公司)合成cDNA第一链；设计MIF、IL-17和IL-23引物序列(见表1)，经BLAST比对，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa，宝生物工程大连有限公司)于Rotor-Gene 3000 real-time PCR仪(澳大利亚Corvett Research公司)上进行定量检测；检测数据用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0软件和双标准曲线法进行分析。

1.2.3 血清MIF、IL-17和IL-23水平 采用ELISA法检测，所有受试者于8：00～9：00采集空腹外周静脉血3 ml，2 390×g离心5 min后吸取血清，-70 ℃保存待测。MIF、IL-17和IL-23试剂盒均购自美国R&D公司，严格按照试剂盒操作要求进行检测。

表1 MIF、IL-17、IL-23及β-actin引物序列

注：MIF=巨噬细胞游走抑制因子

2 结果

2.1 PBMCs中MIF、IL-17和IL-23 mRNA表达水平

2.1.1 RT-PCR曲线 目的基因(MIF、IL-17和IL-23)和内参基因(β-actin)标准曲线直线拟合度良好，直线相关性好，可在较宽范围内进行定量分析(见图1)；扩增曲线呈S型，整条曲线走行光滑，重复表现一致，扩增结果理想(见图2)；熔解曲线表现为单峰，扩增特异性和重复性良好(见图3)。

2.1.2 mRNA表达水平 病例组MIF、IL-17和IL-23 mRNA表达水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01，见表2)。

2.2 血清MIF、IL-17和IL-23水平 病例组血清MIF、IL-17和IL-23水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01，见表2)。

注：MIF=巨噬细胞游走抑制因子

图1 β-actin、MIF、IL-17和IL-23 RT-PCR的标准曲线

Figure1 The standard curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

图2 β-actin、MIF、IL-17和IL-23实时定量RT-PCR的扩增曲线

Figure2 The amplification curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

2.3 相关性分析 线性相关分析结果显示，AD患儿PBMCs中MIF mRNA表达水平(r=0.418，P=0.011，见图4A)及血清MIF水平(r=0.419，P=0.011，见图4B)与SCORAD评分均呈正相关；PBMCs中MIF mRNA表达水平与IL-17 mRNA、IL-23 mRNA表达水平均呈正相关(rIL-17 mRNA=0.395，P=0.017，见图4C；rIL-23 mRNA=0.422，P=0.010，见图4D)，血清MIF水平与IL-17、IL-23水平均呈正相关(rIL-17=0.407，P=0.014，见图4E；rIL-23=0.375，P=0.024，见图4F)。

图3 β-actin、MIF、IL-17和IL-23实时定量RT-PCR的熔解曲线

Figure3 The melt curve of β-actin，MIF，IL-17 and IL-23 by real-time RT-PCR

Table2 Comparison of mRNA expression of MIF，IL-17 and IL-23 in PBMCs and serum levels between the two groups

组别例数mRNA表达水平MIF IL-17 IL-23血清水平MIF(μg/L) IL-17(ng/L) IL-23(ng/L)对照组331.83±0.691.77±0.510.92±0.22 9.80±2.21 11.71±2.0818.97±4.39病例组365.93±2.356.76±1.873.21±0.7334.92±8.7333.29±5.7054.62±9.69t值10.03915.40517.91516.67821.23819.940P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：PBMCs=外周血单个核细胞

图4 AD患儿MIF与疾病严重程度评分及IL-17、IL-23的相关性

Figure4 Correlation between MIF and SCORAD score，IL-17，and IL-23 in AD children

3 讨论

MIF是一种重要的免疫调节因子，在多种变应性疾病的发生、发展中发挥着重要作用[7-10]。本研究结果显示，病例组患儿PBMCs中MIF mRNA表达水平及血清MIF水平均高于对照组，且线性相关分析结果显示，AD患儿PBMCs中MIF mRNA表达水平及血清MIF水平均与SCORAD评分呈正相关。MIF与T淋巴细胞存在相互作用，活化的T淋巴细胞是MIF的主要来源，当T淋巴细胞受到特异性抗原刺激后，T淋巴细胞中MIF mRNA表达水平和蛋白分泌量均明显增多，应用抗MIF抗体后抗原特异性T细胞的增殖受到明显抑制[11]；反之，MIF又可促进T细胞的增殖及多种细胞因子的产生。

综上所述，MIF在AD患儿中高表达，且与IL-17、IL-23密切相关，炎性因子间的相互作用可能共同参与了AD的发生、发展。但本研究样本量较小，且为单中心研究，各细胞因子间的作用途径、方式及可能机制尚有待深入探讨，这也是今后的研究重点和方向。

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