慢性肾脏病骨-肾-甲状旁腺轴相关因子及影响因素研究

黎艳培，廖蕴华，潘 玲，丁文娟

我国慢性肾脏病(CKD)的患病率已达到10.8%[1]。钙磷代谢紊乱是CKD的常见并发症，其能增加CKD患者心血管事件的发生率和病死率。近年来发现骨-肾-甲状旁腺轴是钙磷代谢的重要调节轴，成纤维生长因子23(FGF23)、klotho蛋白是该轴的重要组成因子，本研究通过分析不同分期CKD患者FGF23、klotho蛋白、1,25-二羟维生素D3〔1,25-(OH)2D3〕及传统钙磷相关指标水平，探讨不同时期CKD患者骨-肾-甲状旁腺轴相关因子之间的关系。

1 资料与方法

1.1 病例入选标准 符合美国肾脏基金会慢性肾脏疾病进展监测与防治指南(National Kidney Foundation-Dialysis Outcomes Quality Initiative，NKF-DOQI)制定的CKD诊断标准及分期[2]，年龄>18岁，未进行过肾脏替代治疗。

1.2 病例排除标准 合并急性肾损伤，系统性自身免疫性疾病导致的肾炎，原发性甲状旁腺功能亢进，肝胆疾患，既往6个月内使用免疫抑制剂治疗，近1个月内规律使用钙剂、磷结合剂及维生素D制剂者。

1.3 临床资料 选择2012年10月—2013年3月于广西医科大学第一附属医院就诊的符合研究标准的137例CKD非透析患者，其中男75例、女62例，平均年龄(46.0±14.1)岁。CKD病因构成：原发性肾小球疾病97例(70.8%)，高血压肾损害20例(14.6%)，糖尿病肾病11例(8.0%)，高尿酸性肾病7例(5.1%)，梗阻性肾病2例(1.5%)。选择同期于我院体检中心行体检健康者35例为对照组，其中男14例、女21例，平均年龄(40.4±15.2)岁。

1.4 观察指标及检测方法 收集两组受试者的性别、年龄、体质指数(BMI)、血压、CKD病因。受试者清晨空腹抽取静脉血，3 000 r/min离心10 min(离心半径为10 cm)，取上清，于-80 ℃冰箱储存。使用日本日立7600型血生化自动分析仪检测血肌酐、清蛋白、血钙、血磷、血碱性磷酸酶(ALP)，采用放射免疫法检测全段甲状旁腺激素(iPTH)。患者血钙经过校正，校正钙(mmol/L)=血测定钙(mmol/L)+0.2×〔4-0.1×清蛋白(g/L)〕。FGF23、klotho蛋白、1,25-(OH)2D3的检测采用ELISA双夹心法，试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。根据改良简化MDRD公式计算估算肾小球滤过率(eGFR)。根据eGFR 将CKD组分为4组：CKD 1～2期组〔eGFR≥60 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 3期组〔eGFR 30～59 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 4期组〔eGFR 15～29 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕、CKD 5期组〔eGFR <15 ml·min-1·(1.73 m2)-1〕。

2 结果

2.1 临床资料比较 CKD各组及对照组的性别构成间差异无统计学意义(P=0.11)，CKD 1～2期组年龄低于CKD其他分组(P<0.05)。CKD 1～2期组血清iPTH、ALP、FGF23水平与对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)；CKD 3、4、5期组血清iPTH、ALP、FGF23水平较对照组升高，1,25-(OH)2D3水平较对照组降低(P<0.05)，其中CKD 4、5期组iPTH、FGF23较CKD 3期升高，且CKD 5期又高于CKD 4期(P<0.05)，ALP、1,25-(OH)2D3水平CKD 3、4、5期组间差异无统计学意义(P>0.05)；CKD 4、5期血钙较对照组降低，血磷、klotho蛋白较对照组升高(P<0.05)，其中CKD 5期组血磷又较CKD 4期升高(P<0.05)，CKD 4、5期组血钙、klotho蛋白水平间差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 单因素相关分析 将年龄、BMI、平均动脉压(MAP)、清蛋白、血红蛋白、血钙、血磷、iPTH、eGFR、ALP、1,25-(OH)2D3、klotho蛋白、胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)与FGF23进行Spearman相关分析，结果显示，FGF23与血磷(r=0.432，P<0.001)、iPTH(r=0.409，P<0.001)、ALP(r=0.372，P<0.001)、klotho蛋白(r=0.383，P<0.001)、MAP(r=0.276，P<0.001)呈正相关；与eGFR(r=-0.600，P<0.001)、血钙(r=-0.192，P=0.012)、1,25-(OH)2D3(r=-0.228，P=0.003)、HDL(r=-0.252，P=0.001)、清蛋白(r=-0.273，P<0.001)、血红蛋白(r=-0.449，P<0.001)呈负相关。

2.3 多元逐步线性回归分析 以lgFGF23为因变量,以血磷、iPTH、ALP、klotho蛋白、MAP、eGFR、血钙、1,25-(OH)2D3、HDL、清蛋白、血红蛋白、性别、病因为自变量进行多元逐步回归分析，被筛选引入方程的因素有：eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL，经检验F=32.966，P<0.001,此4项因素对lgFGF23影响有统计学意义，模型的R2为0.447，调整R2为0.434，其余检验统计量值见表2。从标准化偏回归系数看，对lgFGF23影响效果由大到小的因素依次是eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL。回归方程为：lgFGF23=1.239-0.331eGFR蛋白+0.310血磷+0.173klotho蛋白-0.151HDL。

表1 不同CKD组及对照组一般资料及钙磷代谢指标比较

注：与对照组比较，*P<0.05;与CKD 1～2期组比较，△P<0.05；与CKD 3期组比较，▲P<0.05；与CKD 4期组比较，○P<0.05；★为χ2值，☆为F值，◆为H值；eGFR=估算肾小球滤过率，iPTH=全段甲状旁腺激素，ALP=碱性磷酸酶，FGF23=成纤维生长因子-23，1,25-(OH)2D3=1，25-二羟维生素D3

表2 FGF23影响因素的多元逐步线性回归分析

Table2 Multiple linear regression analysis on influencing factors for FGF23

影响因素偏回归系数标准误标化偏回归系数t值P值常数项1 2390 10611 641<0 01eGFR-0 0030 001-0 331-4 649<0 01血磷0 2850 0600 3104 740<0 01klotho蛋白0 1720 0620 1732 760<0 01HDL-0 0820 033-0 151-2 4900 014

注：HDL=高密度脂蛋白

3 讨论

FGF23/klotho蛋白是近年来发现的在钙磷代谢中起着关键作用的因子，FGF23/klotho蛋白、1,25-(OH)2D3、PTH之间形成骨-肾-甲状旁腺调节轴，共同调节机体钙磷代谢的平衡。正常生理情况下，骨原细胞及成骨细胞分泌的FGF23与肾脏klotho-FGFR1结合后,抑制近曲小管刷状缘2a型及2c型钠磷协同转运体(NaPi-2a/NaPi-2c)促进磷的排泄[3]；当血磷升高时，刺激FGF23的生成。FGF23还抑制PTH及1,25-(OH)2D3的生成,而PTH刺激FGF23及1,25-(OH)2D3的生成，升高的1,25-(OH)2D3反过来抑制PTH的生成，同时进一步刺激FGF23及klotho蛋白的产生，间接抑制PTH的生成，由此，骨-肾-甲状旁腺之间的正负反馈形成[4]。CKD时此轴紊乱，可导致一系列矿物质及骨代谢紊乱。

本研究中，CKD 3、4、5期组FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3水平较对照组发生明显改变，而血钙、血磷及klotho蛋白则在CKD 4～5期组发生明显改变，说明FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3等水平改变要早于血钙、血磷及klotho蛋白。宦红娣等[5]研究发现，FGF23在CKD 3期后水平逐期升高，而1,25-(OH)2D3在CKD 3期后明显下降，但CKD 3、4期及腹膜透析组组间无明显差异，本研究结果与之相似。国外研究发现，FGF23在CKD 1～2期呈基线水平，当eGFR<47 ml·min-1·(1.73 m2)-1后升高，升高的FGF23与全因死亡率及心血管事件发生率有着很好的相关性，而血清钙磷水平在eGFR>40 ml·min-1·(1.73 m2)-1前无明显改变[6-8]。本研究显示，FGF23自eGFR<60 ml·min-1·(1.73 m2)-1后开始出现升高。CKD患者中FGF23水平升高的具体机制尚未十分明确，有观点认为，CKD患者随着肾单位的丧失及各种代谢的紊乱，肾脏中FGF23的特异性共受体膜结合型klotho蛋白(FGF23须通过其产生作用)减少，造成FGF23抵抗，削弱FGF23的促磷排泄及抑制PTH分泌的正常功能；此外，高磷血症、甲状旁腺功能亢进均进一步刺激FGF23的生成，打破骨-肾-甲状旁腺之间的调节轴，形成恶性循环[9]。1,25-(OH)2D3减少在CKD早期便已存在，随着eGFR的下降呈线性下降，eGFR每减少1个单位1,25-(OH)2D3水平下降0.3 ng/L，本研究中1,25-(OH)2D3水平在CKD 3期后才出现变化，但在CKD 3、4、5期组间两两比较无明显差异，提示CKD 3期后1,25-(OH)2D3未进一步下降，可能与种族、生活方式及CKD 1～2期组患者相对年轻有关。Regidor等[10]在对73 960例透析患者的队列研究发现， ALP升高，尤其是ALP≥120 U/L后显著增加了患者的死亡风险，本研究中ALP水平在CKD 3期后已逐步升高，血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼，本研究排除了肝胆疾病患者，提示升高的ALP部分可能来自于成骨细胞，由于本研究测定的是总ALP水平，不能准确评估成骨细胞活性，因此建议CKD 3期后加测骨特异性碱性磷酸酶水平。

本研究显示，eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL是FGF23的独立影响因素。随着肾功能的下降FGF23升高已普遍达成共识。高血磷是FGF23生成的刺激因素，Ito等[11]对健康志愿者静脉注射磷酸盐，使血磷快速升高，6 h后留血测定FGF23水平，发现FGF23水平并无改变；另一项研究对CKD 4期患者予司维拉姆8周的干预，结果显示可降低FGF23水平[12]，而予碳酸镧2周干预并不降低FGF23水平[13]，提示短时间内血磷急剧改变可能并不调节FGF23的分泌，长期的磷负荷或可影响FGF23水平。本研究中FGF23的改变较血磷早，提示早期测定FGF23水平有助于评估体内磷负荷情况。

本研究血清klotho蛋白与FGF23呈正相关，考虑与膜结合型klotho蛋白的减少导致FGF23抵抗有关。klotho蛋白分为膜结合型及分泌型，膜结合型存在于肾远曲小管，血液中存在的klotho蛋白可来源于酶切的膜结合型klotho蛋白胞外段及分泌型klotho蛋白，在部分CKD研究中血清klotho蛋白是降低的，而本研究中该蛋白从CKD 4期后升高，与Sugiura等[14]及Devaraj等[15]的研究结果类似。由于klotho蛋白在人体多个器官均有表达，猜测可能与肾单位受损后肾外组织代偿性生成有关，需进一步行组织中klotho蛋白检测证实。

本研究显示，HDL与FGF23呈负相关。HDL是公认的抗动脉粥样硬化因子，具有抗氧化应激作用[16]，而CKD患者脂代谢紊乱及氧化应激较普遍，控制HDL水平是否有助于改善FGF23水平仍需进一步研究。

综上所述，CKD患者FGF23、iPTH、ALP、1,25-(OH)2D3水平改变早于血钙、血磷、klotho蛋白；eGFR、血磷、klotho蛋白、HDL是FGF23的独立影响因素。由于本研究为横断面研究，未能了解骨-肾-甲状旁腺轴相关因子对患者预后的影响，有待日后开展进一步的队列研究。

1 Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:A cross-sectional survey[J].Lancet,2012,379(9818):815-822.

2 Levey AS,Coresh J,Balk E,et al.National Kidney Foundation practice guidelines for chronic kidney disease:Evaluation,classification,and stratification[J].Ann Intern Med,2003,139(2):137-147.

3 Miyamoto K,Ito M,Tatsumi S,et al.New aspect of renal phosphate reabsorption:The type IIc sodium-dependent phosphate transporter[J].Am J Nephrol,2007,27(5):503-515.

4 Hu MC,Shiizaki K,Kuro-o M,et al.Fibroblast growth factor 23 and klotho:Physiology and pathophysiology of an endocrine network of mineral metabolism[J].Annu Rev Physiol,2012,75:503-533.

5 宦红娣,张军力,张景红,等.慢性肾脏病患者钙磷代谢及调节因子的变化[J].临床内科杂志,2008,25(11):743-746.

6 Isakova T,Xie H,Yang W,et al.Fibroblast growth factor 23 and risks of mortality and end-stage renal disease in patients with chronic kidney disease[J].JAMA,2011,305(23):2432-2439.

7 Pavik I,Jaeger P,Ebner L,et al.Secreted Klotho and FGF23 in chronic kidney disease stage 1 to 5:A sequence suggested from a cross-sectional study[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(2):352-359.

8 Levin A,Bakris GL,Molitch M,et al.Prevalence of abnormal serum vitamin D,PTH,calcium,and phosphorus in patients with chronic kidney disease:Results of the study to evaluate early kidney disease[J].Kidney Int,2007,71(1):31-38.

9 Bernheim J and Benchetrit S.The potential roles of FGF23 and Klotho in the prognosis of renal and cardiovascular diseases[J].Nephrol Dial Transplant,2011,26(8):2433-2438.

10 Regidor DL,Kovesdy CP,Mehrotra R,et al.Serum alkaline phosphatase predicts mortality among maintenance hemodialysis patients[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2193-2203.

11 Ito N,Fukumoto S,Takeuchi Y,et al.Effect of acute changes of serum phosphate on fibroblast growth factor(FGF)23 levels in humans[J].J Bone Miner Metab,2007,25(6):419-422.

12 Yilmaz MI,Sonmez A,Saglam M,et al.Comparison of calcium acetate and sevelamer on vascular function and fibroblast growth factor 23 in CKD patients:A randomized clinical trial[J].Am J Kidney Dis,2012,59(2):177-185.

13 Isakova T,Gutierrez OM,Smith K,et al.Pilot study of dietary phosphorus restriction and phosphorus binders to target fibroblast growth factor 23 in patients with chronic kidney disease[J].Nephrol Dial Transplant,2011,26(2):584-591.

14 Sugiura H,Tsuchiya K，Nitta K.Circulating levels of soluble alpha-Klotho in patients with chronic kidney disease[J].Clin Exp Nephrol,2011,15(5):795-796.

15 Devaraj S,Syed B,Chien A,et al.Validation of an immunoassay for soluble Klotho protein: Decreased levels in diabetes and increased levels in chronic kidney disease[J].Am J Clin Pathol,2012,137(3):479-485.

16 翟振丽，马维红，申炜.高密度脂蛋白与动脉粥样硬化的相关性研究进展[J].中国全科医学，2013，16(12)：4242-4245.