124株金黄色葡萄球菌的耐药性分析及PVL基因检测

魏丹丹，刘洋，邓琼，徐群飞，万腊根

(南昌大学第一附属医院，1、检验科；2、感染科，江西南昌330006)

·论著·

124株金黄色葡萄球菌的耐药性分析及PVL基因检测

魏丹丹1，刘洋1，邓琼2，徐群飞1，万腊根1

(南昌大学第一附属医院，1、检验科；2、感染科，江西南昌330006)

目的调查了解我院临床分离的124株金黄色葡萄球菌的耐药谱特征及PVL基因携带状况,为临床合理使用抗菌药物提供科学依据。方法采用Vitek2 Compact全自动微生物鉴定仪进行菌株鉴定及药物敏感试验，PCR法检测mecA基因、mecC基因和PVL基因。结果耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出率为56.45%(70/124)，MRSA主要分离自烧伤病区，其次是神经外科ICU。MRSA菌株对青霉素G均耐药；对左氧氟沙星、庆大霉素、红霉素、四环素、复方新诺明和利福平的耐药率分别为57.1%、67.1%、85.7%、80.07%、28.6%、37.1%；MRSA对多种常用抗菌药物的耐药率普遍高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)，差异有统计学意义(P＜0.05)；MRSA和MSSA对呋喃妥因、喹奴普汀／达福普汀、利奈唑胺的耐药率分别为2.9%、11.4%、2.9%；0.0%、5.6%、5.6%，差异无统计学意义(P＞0.05)。检出6株PVL阳性，其中MRSA和MSSA各占3株。结论我院分离的金黄色葡萄球菌对抗菌药物呈多重耐药性,MRSA菌株耐药率明显高于MSSA,应加强对MRSA的监测,指导临床合理使用抗菌药物，加强对呋喃妥因、喹奴普汀／达福普汀、利奈唑胺耐药菌株的检测及PVL基因的检测，防止此类菌株的播散。

金黄色葡萄球菌；MRSA；耐药性；杀白细胞素

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.009

金黄色葡萄球菌可引起皮肤软组织感染和身体其他部位的广泛感染，是医院感染和社区获得性感染的常见病原菌之一[1]。我院作为江西省最大的省级三级甲等综合性医院之一，前期临床监测结果显示，金黄色葡萄球菌的耐药问题显著突出，尤其是MRSA,呈多重耐药，严重影响临床抗感染的治疗，而携带有PVL基因的金黄色葡萄球菌主要引起化脓性皮肤感染和坏死性肺炎，使治疗更为棘手。本研究旨在对我院临床分离的124株金黄色葡萄球菌进行耐药性分析及PVL基因检测，以指导临床医生合理选择抗生素。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源收集2013年6月至2013年12月南昌大学第一附属医院临床各种标本分离的124株非重复的金黄色葡萄球菌作为实验菌株。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，由本实验室保存。

1.1.2 主要仪器和试剂法国生物梅里埃公司的Vitek2 Compact全自动微生物鉴定仪、德国Eppendorf公司的MyGenie96/384型PCR仪、美国BIO. RAD公司的DYY-6D型电泳仪、北京六一公司的凝胶成像仪；PCR试剂和DNAMarkerI购于TaKaRa大连宝生物公司。

1.1.3 相关扩增引物相关引物由上海生工生物技术有限公司合成。见表1。

表1 引物序列名称及相应序列

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验分离培养后的可疑菌株由Vitek2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定及药敏试验，药敏判断标准及质控遵循2011年版CLSI标准执行。

1.2.2 MRSA的鉴定通过表型和基因型检测进行MRSA鉴定。表型检测：采用头孢西丁最低抑菌浓度(MIC)法，由Vitek2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定。基因型检测：溶菌酶煮沸法提取细菌DNA，采用PCR法检测mecA、mecC基因，反应体系：总反应体积25μl,其中10×buffer 2.5μl(含MgCl2)，dNTPs2μl，rTaq酶0.125μl，上下游引物各0.5μl，DNA模板3μl，双蒸水补足25μl。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

1.2.3 PVL基因检测细菌DNA提取同上，反应条件同上。

1.2.4 扩增产物电泳PCR产物在1.2%的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中进行电泳后，用凝胶成像系统观察结果,将阳性扩增产物送上海生工生物有限公司测序，并在GenBank(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／)进行比对分析。

2 结果

2.1 MRSA的检测结果124株金葡菌有65株对头孢西丁耐药，表型检出率为52.4%，124株金葡菌有64株携带mecA基因，均未检出mecC基因，基因型检出率为51.7%，检出6株对头孢西丁耐药而mecA基因阴性菌株，5株mecA基因阳性,头孢西丁敏感菌株，参照2011年版CLSI标准，携带有mecA基因或苯唑西林、头孢西丁耐药的金黄色葡萄球菌为MRSA，则MRSA的检出率为56.45%(70/ 124)。

2.2 MRSA与MSSA耐药率比较全部MRSA菌株对青霉素G耐药；对左氧氟沙星、庆大霉素、红霉素、四环素、复方新诺明和利福平的耐药率分别为57.1%、67.1%、85.7%、80.07%、28.6%、37.1%。MRSA对多种常用抗菌药物的耐药率普遍高于MSSA(P＜0.05)。MRSA和MSSA对呋喃妥因、喹奴普汀／达福普汀、利奈唑胺的耐药率分别为2.9%、11.4%、2.9%；0.0%、5.6%、5.6%(P＞0.05)。未发现万古霉素耐药菌株。MSSA和MRSA对抗菌药物的敏感性详见表2。

2.3 PVL基因检测124株金黄色葡萄球菌检出6株PVL基因阳性，检出率为4.84%，其中MRSA和MSSA各占3株，差异无统计学意义(χ2=0.11，P＞0.05)。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的常见病原菌之一[1],青霉素的问世曾一度使金黄色葡萄球菌的感染得到了控制，然而，随之产生的即是抗生素的耐药问题，自1961年临床首次发现MRSA以来，MRSA的分离率逐年上升，其多重耐药性导致医疗费用增加，死亡率升高，给临床治疗带来挑战[2，3]。

MRSA的耐药性是由于产生了一种由mecA基因介导编码的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a为葡萄球菌青霉素结合蛋白PBP2的异构体，同样具有转肽酶活性，但与PBP2不同的是PBP2a与β-内酰胺类抗菌药物结合力较弱。由于β-内酰胺类不能抑制PBP2a的转肽酶活性，致使细菌的细胞壁依然能够合成而得以生存[4]。国外不断研究报道检出除mecA基因以外的新的基因型mecC[5],国内还没有相关的报道,本研究未检测出mecC基因。

本研究临床分离的MRSA占56.45%(70/124)，高于2011年中国CHINET细菌耐药监测报道的全国15所医院的平均检出率50.6%[6]，菌株主要分离自烧伤病区，烧伤患者由于各种屏障多遭到不同程度的破坏，所以更容易引起各种感染。药敏结果显示：我院分离的MRSA具有多重耐药性，其对多种常用抗生素的耐药率普遍高于MSSA,差异有统计学意义(P＜0.05)，MRSA和MSSA均出现不同程度地对呋喃妥因、喹奴普汀／达福普汀、利奈唑胺耐药菌株，表明我院金黄色葡萄球菌耐药性严重，应加强微生物室与临床医生的联系和沟通，适时进行实验室监测，尽量避免此类耐药菌株在临床大量出现，防止其在医院内的扩散和流行。本研究未发现万古霉素耐药菌株，说明万古霉素仍可作为金黄色葡萄球菌感染的首选药物，但自1996年日本首次报道了万古霉素不敏感菌株Mu3(万古霉素MIC为4.0μg/ml)[7],2002年美国从临床检出世界上第1株携带vanA基因的VRSA(耐万古霉素SAU)以来[8]，国内外报道万古霉素不敏感株(VISA)或万古霉素耐药株(VRSA)不断增多，提示需要加强对万古霉素的耐药监测。

本研究中出现了6株对头孢西丁耐药而mecA基因阴性的菌株，分析原因可能与菌株产生高水平的β-内酰胺酶或存在PBP2a以外的低亲和力PBP有关，还需进一步证实。另外，还发现5株mecA基因阳性,但对头孢西丁敏感的临床菌株,可能与mecA基因本身的表达受到抑制或其辅助基因失活有关，其机制还需要作进一步研究。表型与基因型不一致的现象,可能还受环境因素的影响,如生长温度、培养时间、pH值、渗透压、二价金属离子等[9]，造成MRSA耐药程度的差异,从而影响MRSA的检测结果。

杀白细胞毒素(PVL)是金黄色葡萄球菌产生的一种可以导致严重坏死性疾病的毒素，携带有PVL基因的金黄色葡萄球菌通常与皮肤软组织感染相关,特别是蜂窝组织炎、脓肿、疖肿等疾病,甚至导致坏死性肺炎，有较高的死亡率[10，11]，PVL在社区获得性MRSA(CA-MRSA)中携带率较高，而在医院相关性MRSA(HA-MRSA)中携带率较低。本研究中，124株金黄色葡萄球菌中有6株PVL阳性，阳性率为4.84%，低于李春[12]等人报道的PVL阳性率4.9%，其中MRSA和MSSA各占3株，均主要分离自外科病区，提示医护人员应严格遵守无菌操作，防止此类菌株的播散。尽管本院PVL基因的检出率较低，由于金葡菌广泛分布于各科室，适时加强对PVL基因的监测，对做好医院感染控制，及时采取有效的隔离措施，有十分重要的意义。

总之，我院金黄色葡萄球菌的耐药现状严重，作为临床实验室，我们应正确、及时地对金黄色葡萄球菌的耐药性进行监测和流行病学研究，为临床提供准确、可靠的用药依据，同时加强与临床医生的联系与沟通，并通过提高感染性疾病的标本送检率来严格控制抗菌药物的使用。作为医护人员应严格遵守无菌操作原则，从而延缓细菌耐药株发生，带来强大的社会经济效益。

表2 MSSA和MRSA对常用抗菌药物的耐药率(%)

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Drug resistance and PVL gene detection of 124 strains of Staphylococcus aureus

WEI Dandan,LIU Yang，DENG Qiong,et al.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To investigate the drug-resistance and carriage of Panton-Valentine leukocidin(PVL)gene of 124 Staphylococcus aureus isolated from the hospitalized patients to guide the clinical treatment.Methods 124 Staphylococcus aureus isolates were tested by Vitek 2 Compact automatic microorganism identifying,and the drug sensitivity tests were also performed by it.MecA gene、mecC gene and PVL gene were detected by PCR.Results Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)accounted for 56.45%(70/124),which mainly came from Burns ward and secondly came from Neurosurgery Intensive Care Unit (NICU).All MRSA strains were resistant to penicillin G,and the resistance rates of levofloxacin,gentamicin,erythromycin,tetracycline,SMZ-TMP and rifampicin were 57.1%,67.1%,85.7%,80.07%,28.6%and 37.1%,repectively.For many drug resistances, there was statistical difference between MRSA and methicillin susceptible Staphylococcus aureus(MSSA)(P＜0.05).The drug resistance rates of MRSA were 2.9%,11.4%,2.9%in Nitrofurantoin,Quinupristin-Dalfoprisdn and Linezolid,0.0%,5.6%,5.6%referring to MSSA.6 of 124 Staphylococcus aureus carried PVL genes.Conclusions The Staphylococcus aureus strains from our hospital were multi-drug resistant for antibiotics,and the drug resistance rate of the MRSA strains was higher than the MSSA strains. The surveillance of MRSA should be strengthened to guide clinical medicine,the same with the surveillance of Nitrofurantoin, Quinupristin-Dalfoprisdn and Linezolid resistant Staphylococcus aureus and PVL genes.

Staphylococcus aureus；MRSA；Drug-resistance；PVL

R446.6，Q939.92，R378.1+1

A

1674-1129(2014)06-0677-03

2014-08-08；

2014-09-23)

江西省教育厅青年科学基金项目编号：GJJ14178

魏丹丹，女，1987年出生，南昌大学医学院在读研究生，主攻临床微生物学及常见细菌致病性及耐药性机制的研究。

万腊根，硕士生导师。