大黄素对大鼠糖尿病视网膜病变发展的影响

李明存，刘远光，张 涤，王冬兰

(佳木斯大学附属第一医院眼科，黑龙江 佳木斯 154003)

糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见和严重的微血管并发症之一。随着糖尿病患病率的逐年增高以及患病人群年龄有开始向低的趋势，DR已成为致盲的主要原因之一，这在很大程度上对患者、家庭和社会均造成极大的危害和负担。目前已有多种药物和制剂被用于防治DR的发生和进展，但由于DR的发病机制尚未有确切结论，尽管某些药物临床前实验和临床研究已取得了令人鼓舞的结果，但尚无一种药物能有效控制DR的发展，因此寻找并筛选防治DR的药物受到国内外医学界的高度重视。有实验研究表明大黄素对血管平滑肌细胞的增殖有抑制作用[1]，且对高糖条件下的视网膜血管内皮细胞的增殖的抑制与有很多相似性[2]，因此从这一点出发，我们推测大黄素可能对DR的增殖趋势也具有抑制作用。本研究通过复制糖尿病大鼠模型，给予大黄素后，观察大鼠视网膜中FN和CD105表达情况的变化，研究大黄素对糖尿病视网膜病变的影响，以期为临床治疗提供佐证和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组

健康Wistar大鼠78只，体重180～200g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物一般情况良好，皮毛光泽，进食与活动正常，自然光线条件下适应性喂养7d后，随机分为3组：正常对照组、DR组、DR+大黄素组。

1.1.2 试剂与仪器

大黄素购自西安飞达生物技术有限公司；STZ(Sigma 公司)由上海宝曼生物技术有限公司提供；兔抗大鼠FN、CD105单克隆抗体由武汉博士得生物工程有限公司提供；ONETOUCHSelectSimple稳择易血糖仪及其配套试纸由美国强生(中国)医疗器材有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立与处理

正常组大鼠始终给予常规饲养条件，不做特殊处理。适应性喂养一周后将DR组和DR+大黄素组大鼠给予高脂高糖饮食6周，禁食24h，腹腔注射STZ 30mg·kg-1，72h后连续3d尾静脉取血，用强生稳择易血糖仪检测血糖含量在16.7以上者为造模成功，作为糖尿病实验对象。实验期间大鼠继续辅以高脂高糖饮食，每周观测血糖，每天监测体质量。实验结束时，去除中间死亡鼠及血糖恢复鼠，每组以25只作为实验统计样本。治疗组于造模成功后4周开始按照0.3g/kg·d经胃给药，DR组给予相同剂量的温水。

1.2.2 取材

各组大鼠以STZ注射造模成功后开始算起，分别于第6、8、10、12、14周以多聚甲醛心脏灌注处死5只大鼠，取出完整眼球，置于4 %多聚甲醛溶液固定并石蜡包埋，以行免疫组化检测。

1.2.3 免疫组化

取大鼠眼球，经固定，石蜡包埋，切片，烤片制成组织芯片，脱蜡、梯度酒精至水，PBS冲洗，枸橼酸盐酸缓冲液微波加热抗原修复，3%H2O2溶液阻断内源性过氧化酶，PBS冲洗，山羊血清封闭，一抗孵育4℃过夜，PBS冲洗，二抗孵育30min，PBS冲洗，DAB显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差(即)表示，采用单因素方差分析法，各组间比较采用LSD检验和Dunnet’s T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FN在各个时期的表达

见表1。

2.2 CD105在各个时期的表达

见表2。

表1 FN在大鼠视网膜中各时期的表达

*vs空白组P<0.05，**vs空白组P<0.01，△vs对照组P<0.05，△△vs对照组P<0.01。

表2 CD105在大鼠视网膜中各时期的表达

vs空白组P<0.01，vs对照组P<0.01。

3 讨论

糖尿病性视网膜病变(DR)是一个多因素的复杂疾病过程。我国糖尿病患者中糖尿病性视网膜病变的患病率达44%～51.3%[4]。在组织学上，糖尿病性视网膜病变的改变主要是毛细血管功能和结构的异常改变，血管的通透性改变，出现微血管瘤和新生血管等；在分子水平上，则是促进新生血管因子与抑制因子之间的平衡被打破。当糖尿病视网膜病变发展到一定阶段时, 视网膜组织随着缺血缺氧的加重, 视网膜毛细血管内皮细胞产生一系列因子促使新生血管生成新生血管的形成,包括毛细血管基底膜的降解、内皮细胞的迁移增殖以及管腔的形成[3]。本研究拟从糖尿病大鼠模型以及糖尿病视网膜病理改变入手，利用链脉佐菌素(STZ)腹腔注射，配合高脂高糖饮食建立糖尿病大鼠模型，观察大黄素对大鼠视网膜病理形态学改变以及对视网膜免疫组化处理后FN和CD105表达的改变。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是一种大分子多功能的细胞外基质糖蛋白，可由内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等多种细胞产生，广泛存在于细胞表面、细胞外液、结缔组织及大部分基底膜。在其它疾病的研究中发现，细胞外基质成分中的纤维黏连蛋白在增进细胞的黏附，促进细胞的迁移及分化，参与细胞骨架构建及细胞形态的形成中有着活跃的功能。CD105具有特殊的组织学标记，在内皮细胞显著表达，并能选择内皮细胞，在人类微血管内皮细胞和增生的血管内皮细胞中，CD105已被检测出大量表达于细小的和尚未成熟的血管中，尤其在再生组织和炎症组织中。本实验表明，在糖尿病大鼠视网膜组织中，FN与CD105的表达均高于正常大鼠，且与疾病进展成正向的相关性，在应用大黄素进行药物治疗后，FN的表达结果较未治疗组明显著下降，而CD105的表达则呈显著下降。因此大黄素对DR有一定的治疗作用，可能通过其抗炎作用而抑制新生血管及纤维组织的增生，这为DR的治疗提供了一个新的视角。

[1]王翔飞，葛均波，孙爱军，等．大黄素通过p53途径抑制血管平滑肌细胞增殖的实验研究[J].中华心血管病杂志，2006，34(1)：44

[2]刘光辉．大黄素对高糖条件下VEGF 表达及人视网膜血管内皮细胞增殖的影响[D].衡阳：南华大学，2012

[3]王虹, 吉雷, 刘远光，等.结缔组织生长因子与糖尿病并发的眼部缺血缺氧性疾病[J].黑龙江医药科学，2011，36(6)：72

[4]崔翠,齐艳秀,宿星杰，等.糖尿病性视网膜病变的病因与治疗的研究进展[J].黑龙江医药科学，2011，34(3)：68