肾茶对UUO大鼠肾组织FaS、FasL表达的影响

王丽敏，田玉凤，谭振香，郭佳丽，Amrita Shrestha(尼泊尔)，王 超

(佳木斯大学附属第一医院儿科，黑龙江 佳木斯 154003)

肾茶作为传统民间药物已流传使用了几百年，民间常用来治疗急慢性肾炎、泌尿系统结石、膀胱炎、痛风、动脉硬化、黄疸、咽炎，风湿性关节炎等疾病。毒性小，使用安全。本实验旨在研究肾茶对UUO大鼠肾小管上皮细胞Fas、FasL表达的影响,揭示肾茶在肾间质纤维化形成中保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

72只清洁级SD大鼠，雄性，体重(100±5)g,购自长春实验动物中心。随机分为假手术组、模型组、肾茶组3组,每组24只，模型组、肾茶组分别行左侧输尿管结扎、离断,假手术组只将左侧输尿管分离,不结扎、离断。肾茶组给予剂量为8g/kg的肾茶煎剂灌胃，模型组、假手术组则给予等体积0.9%生理盐水代替灌胃。

1.2 建立UUO模型

按照董飞侠，何立群等人报道的方法进行[1]。采用10%水合氯醛(0.35mL/100g计算)将大鼠麻醉,待麻醉起效后将大鼠固定为左侧俯卧位, 在其左侧肋脊角下方约0.5cm的皮肤处纵行切开,将其皮下组织及肌层钝性分离,暴露左侧肾脏,分离其左输尿管,并于中上1/3处结扎,离断，使左肾梗阻,逐层缝合完毕后，背部皮下注射5万U青霉素钠。假手术组大鼠暴露左肾后只分离输尿管,不结扎。

1.3 实验方法

购置大鼠后,放置在清洁级饲养房并适应性喂养1周,造模成功后, 分别于术后3d、7d、14d各组分别随机选取8只大鼠，麻醉后心脏取血，用来测定血尿素氮、血肌酐，处死大鼠并摘取其左侧肾脏,左肾组织采用免疫组化法检测蛋白Fas和FasL。

1.4 试剂及检测

免疫组化试剂盒购自天津所罗门生物制品公司，其中一抗Fas、FasL为兔抗大鼠蛋白抗体。经DAB显色后，将含有黄色颗粒的肾实质及间质细胞视为阳性,免疫组化的结果采用多功能彩色计算图像分析系统进行半定量分析，每例分别随机选取5个高倍视野,计算每个视野内染色区域的面密度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件，三组均数间比较用随机区组方差分析；两组均数间差别用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠血肌酐,尿素氮测定

造模后3d,7d,14d模型组及肾茶组大鼠血Scr、BUN升高，与假手术组相比，各组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);其中模型组上升明显,同假手术组相比,差异有统计学意义(P<0.05);肾茶组与模型组相比各时间点Scr、BUN下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠各时间点血Scr、BUN的变化

注：*与假手术组比较P<0.05;▲与模型组比较P<0.05。

2.2 免疫组化法检测Fas和FasL

2.2.1 Fas及FasL的表达

Fas、FasL主要表达于近端肾小管上皮细胞, 其中皮髓质交界处表达强，而在远端肾小管、系膜细胞、炎症细胞等表达极少。见图1。

2.2.2 Fas、FasL 面密度半定量分析

假手术组大鼠术侧(左侧)肾各时间点Fas、FasL表达均较弱；同假手术组相比，模型组自造模后3d后肾小管上皮细胞Fas、FasL表达愈发增强，各时间点差异均具有统计学意义(P<0.05);同模型组相比，肾茶组造模后各时间点Fas、FasL表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图2 术后各组大鼠FasL的表达(10×40)

表2 各组大鼠各时间点Fas、FasL 面密度半定量分析

注：*与假手术组比较P<0.05;▲与模型组比较P<0.05。

3 讨论

各种原因所致慢性肾脏病进展的共同途径是不可逆的肾脏间质纤维化，这一不可逆的肾损害最终导致肾高血压乃至肾衰竭,而肾脏细胞凋亡在这一病理生理形成的过程中起到了重要的作用[2]。李彪等[3]研究结果显示肾间质纤维化的发展与肾小管上皮细胞的过度凋亡密切相关,而高表达的Fas/FasL导致肾小管上皮细胞凋亡,这一机制最终使肾小管上皮细胞数目减少,临床表现为肾功能下降，这说明Fas系统介导了肾小管上皮细胞的凋亡[4]。UUO模型是结扎单侧输尿管以造成肾功能损伤、间质纤维化、肾小管细胞凋亡及炎症细胞浸润为特征的经典模型,也是目前应用最广泛的肾间质纤维化模型[5]，显著改善UUO模型的肾脏损伤可以通过调控肾小管细胞凋亡而实现[6]。 膜FasL、抗Fas-特殊的抗体和块状可溶的FasL的刺激可引起诱导的含有Fas蛋白的细胞发生凋亡[7]。多种肾脏疾病的发生、发展及修复过程与细胞凋亡有关，而这一过程受多种因素调控[8]，在众多凋亡调控因素中Fas/FasL最具代表性，因其可直接参与启动细胞凋亡[9]。有研究用DNA 断裂的原位末端标记法测得急性肾衰竭时肾小动脉、肾小管及周围区域的细胞凋亡数目增加，肾功能的下降与凋亡小体的不断增加相一致;同时免疫组化结果显示，在UUO肾组织的近曲小管远曲小管周围Fas/FasL表达明显增加，这一结果提示Fas/FasL途径参与了肾小管上皮细胞凋亡的发生，而本研究也有相似的发现。

本实验采用经典的UUO(肾间质纤维化)模型，研究梗阻性肾病时肾茶干预与否的肾小管上皮细胞Fas、FasL的表达的变化，研究结论提示正常的肾脏组织在各时间点Fas、FasL表达少量，当发生肾纤维化时其表达量明显增强，随着造模时间的延长Fas、FasL表达量逐渐增加，这与仙淑丽等人的[10]研究一致。Fas、FasL表达的这种变化可能因为肾发生梗阻时，肾固有细胞凋亡大于细胞增殖，从而导致增殖与凋亡关系的失衡，引起临床上一系列病理生理变化。 肾茶(C.Spicatus)是一种多年生草本植物，唇形科猫须草属(Clerodendranthus)，又称猫须草、牙路妙、猫须公,此药为印度尼西亚草药，当地医生常用治结石病，效果颇著。该药从印尼至南亚诸岛及澳洲均有生长，近年来有应用单味肾茶及其复方制剂治疗尿路感染,肾病综合征[11]、肾衰竭[12]等临床报道。

本研究结果表明，单味肾茶对UUO大鼠肾功能及肾纤维化的发展具有保护作用，其机制之一可能是通过调节Fas/FasL系统，降低Fas、FasL蛋白的表达水平，从而抑制肾小管细胞的凋亡。然而，Fas/FasL系统只是凋亡发生过程中众多传导途径中的其中之一，其抑制凋亡的机制是否还与其他信号传导途径有关，另外，临床上肾茶若与西药结合治疗肾纤维化是否效果更好，均尚待进一步探索研究。

[1]董飞侠，何立群，黄迪，等．单侧输尿管结扎再通大鼠模型的建立方法及其评价[J]．中国比较医学杂志，2010，20(3):30

[2]Maoka T, Tokuda H, Suzuki N, et al.Anti-oxidative, anti-tumor-promoting, and anti-carcinogensis activities of nitroastaxanthin and nitrolutein, the reaction products of astaxanthin and lutein with peroxynitrite[J].Mar Drugs, 2012, 10(6):1391-1199

[3]李彪.肾小管上皮细胞在肾间质纤维化中的作用[J].国外医学·生理-病理科学与临床分册, 2004, 24(1): 65-66

[4]刘宏宝,赵峰,于艳,等.骨髓间充质干细胞对缺血/再灌注损伤肾小管上皮细胞.细胞Bcl-2, Fas/FasL表达的影响[J].中国急救医学,2008,28(1):39-42

[5]张新志，何立群．肾小管间质纤维化动物模型的研究进展[J]．时珍国医国药，2010，21(4):969

[6]谢潮鑫，孟猛,殷先锋，等.天然虾青素对抗肾纤维化及细胞凋亡的作用[J]．基础研究，2013,33(2):305-308

[7]Gordon N，Kleinerman ES．The role of fas/fasL in the metastaticpotential of osteosarcoma and targeting this pathway for the treat-ment of osteosarcoma lung metastases[J]． Cancer Treat Res，2010，(152):497-508

[8]Shah S N，Resar L M． High mobility group A1 and cancer: Potential biomarker and therapeutic target[J].Histol Histopathol，2012，27(5):567-579

[9]Steller H． Mechanisms and genes of cellular suicide[J].Science，1995，267:1445-1449

[10]仙淑丽,刘英莉,沈波,等.bMSCs移植对单侧输尿管结扎大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响[J].上海交通大学学报(医学版),2009，(4): 421-425

[11]王丽敏，王蕾，徐海波，等.肾茶对阿霉素肾病大鼠血清 NF- KB、IL- 8水平的干预研究[J].黑龙江医药科学，2013，36(1):19-20

[12]王立强，孟萍萍，智利，等.肾茶提取物防治大鼠慢性肾功能衰竭的实验研究[J].中国医药科学，2011,1(1):33-35