七个中药复方对小鼠止咳化痰作用的对比实验

2014-02-06张晓菊吴媛蒋春燕张超颖兰新财

中国实验动物学报 2014年2期

张晓菊，吴媛，蒋春燕，张超颖，兰新财

(1.金华职业技术学院;2.金大康动物保健品有限公司浙江金华 321017)

目前养殖场集约化程度高，猪呼吸道疾病综合征(PRDC)发病率增高，是危害养猪生产的最重要疾病之一。据报道，PRDC 发病率一般为5%～60%，发病猪死亡率为20%～90%［1］。高密度的饲养环境使猪体自身正气不足，尤其是特异性抗病正气不足，导致外感温热病邪乘虚而入，侵入机体暂为伏邪。如遇气候环境异常，具有非时令之寒热潮湿，导致猪体正气再衰，机体抗邪无力，则温热病邪逾时而发，使肺气升降失常而表现出咳喘、咽喉肿痛、黏膜发绀、痰浊渗出等临诊症状。因此，根据PRDC 的临床症状、病变特征和病机，中兽医辨证为肺经温(瘟)病范畴，其治疗呼吸道病有四大法:清热解毒、宣肺利咽、化湿消痰、益气养阴。据此，课题组自拟了7 个中药复方，建立以小鼠为实验模型，以筛选、验证这些中药复方制剂止咳化痰的效果，为中药制剂在防治PRDC 上的应用提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级小鼠200 只，6 周龄，体重18～20 g，雌雄各半，由金华市药品检验所提供【SCXK(浙)2010－0046】，实验在金华职业技术学院医学院实验动物中心进行【SYXK(浙)2010－0022】。

1.1.2 中药制剂

选取具有清热解毒、宣肺化痰、益气养阴、利咽消肿的中药原料(各味中药均购自金华市尖峰大药房连锁有限公司)，组成方1、方2、方3、方4、方5、方6 和方7 共七个复方。①方1 组:生石膏、知母、芦根、石菖蒲、前胡、桔梗、麻黄、浙贝、枳壳、炙甘草、五味子;②方2 组:黄芩、炒栀子、芦根、石菖蒲、桔梗、葶苈子、乌梅、瓜蒌仁、冬瓜子、炙甘草;③方3组:生石膏、知母、芦根、桔梗、瓜蒌、贝母、大黄、芒硝、炙甘草;④方4 组:栀子、黄芩、金银花、连翘、前胡、桑白皮、南沙参、麦门冬;⑤方5 组:射干、山豆根、瓜蒌、贝母、桑白皮、葶苈子、苏子、五味子;⑥方6 组:射干、山豆根、黄芩、金银花、鱼腥草、麦门冬、太子参、五味子;⑦方7 组:生石膏、知母、玄参、栀子、黄芩、大黄、葶苈子、苏子、炙甘草。各组中药复方分别加10 倍蒸馏水浸泡半小时后，煎煮1 h，收取滤液，减压浓缩至l g/mL，4℃冰箱保存备用。

1.1.3 药物

浓氨水(NH3)，分析纯，浙江中星化工试剂有限公司生产，批号:20110925;氯化铵，分析纯，衢州巨化试剂有限公司生产，批号:20111001。氢溴酸右美沙芬片，淄博万杰制药有限公司，批号:1201001。临用前用蒸馏水配成所需浓度的混悬液。

1.1.4 仪器

721 型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产。分析天平，上海上天精密仪器有限公司生产。提取中药的仪器:TC－15 套式恒温器，海宁市新华医疗器械厂生产;浓缩中药用R－501 旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 止咳实验(浓氨水引咳法［2］)

实验小鼠随机分9 种处理，分别为空白对照处理(生理盐水按每只0.2 mL 灌服)，阳性处理(右美沙芬按0.1 g/kg 体重，每只0.2 mL 灌服)，七个不同复方的中药处理(按0.1 g/kg 体重，每只0.2 mL灌服)。每个处理均设2 个重复，每重复5 只小鼠(已预先剔除对浓氨水不敏感者)。

实验组上下午各灌胃给药1 次，灌药前4 h、灌药后4 h 内禁食不禁水，连续用药7 d。末次给药后1 h，分别将小鼠逐一置于倒置的500 mL 玻璃容器内，将浓氨水0.2 mL 用注射器尽量均匀的喷洒在棉花团上，盖上器皿一定时间(约10 s)诱咳，观察自盖上器皿后开始至小鼠出现咳嗽的潜伏期及5 min内的咳嗽次数(注:小鼠咳嗽的判断以剧烈收缩腹肌并张嘴为准，时可闻到轻微的咳嗽声)。

1.2.2 化痰实验(气管段酚红法［3］)

除阳性药物用氯化铵按0.1 g/kg 体重，每只0.2 mL 灌服外，其余分组及处理方法同止咳实验。

末次给药30 min 后ip 注射0.5%酚红溶液0.5 mL，30 min 后处死小鼠，剥离气管周围组织，甲状软骨下缘及气管分支处用小血管夹夹住气管，然后剪下甲状软骨下至气管分支处的一段气管，将各气管段放入预先盛有4 mL 5% NaHCO3溶液试管中静置l h，然后于分光光度计546 nm 处测A 值，置4℃存放24 h 后，重测A 值，取二者平均值，根据标准酚红曲线计算酚红含量(μg/mL)。

标准酚红曲线的绘制:分析天平准确称取0.01 g 酚红，加5%碳酸氢钠溶解，配成1 mL 含100 μg，然后顺次稀释成每毫升含酚红0.1、0.3、0.5、0.7、1、3、5、10 μg，用分光光度计测A 值，以酚红剂量为横坐标，A 值为纵坐标，根据酚红浓度和A 值计算出回归方程，绘制酚红标准曲线(图1)。据所测的A值，即可从标准曲线上查出酚红的排泌量。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 止咳实验

各处理对小鼠止咳作用的影响见表1。如表1所示，方5 和方7 组的潜伏时间与右美沙芬组接近，但显著高于对照和其他方剂组(P＜0.05);同时，方5 和方7 组的5 min 内咳嗽次数与右美沙芬组接近，与方2、方3 组均显著低于对照和其他方剂组(P＜0.05)。结果表明，方7 和方5 可延长小鼠咳嗽潜伏期，减少5 min 内咳嗽次数，具有明显的止咳作用。

表1 各中药复方对小鼠的止咳作用(±s ，n=10)Tab.1 Antitussive effect of each Chinese medicine compound on the mice

注:同一列中字母相同者为差异无显著性(P ＞0.05)，字母不同者为差异有显著性(P＜0.05)，下同。Note:The same letter in the same column indicates non－significant difference，P ＞0.05.Different letters indicate significant difference，P＜0.05.The same below.

组别Groups潜伏期时间/ s Incubation period 5 min 内咳嗽次数/次Cough times in 5 min/n方1 组Group 19.357 ±1.77a84.57 ±6.65a方2 组Group 210.229 ±1.00a68.00 ±3.92c方3 组Group 38.029 ±0.60a77.86 ±2.94c方4 组Group 46.857 ±0.63a91.43 ±3.08a方5 组Group 531.629 ±1.71c25.57 ±1.65b方6 组Group 612.671 ±3.31a80.00 ±4.06a方7 组Group 735.614 ±2.38c23.29 ±2.37b右美沙芬组Dextromethorphan group31.029 ±2.76c22.14 ±1.26b生理盐水组Physiological saline group7.586 ±0.95a91.71 ±2.10 a

2.2 化痰实验

各处理对小鼠气管段酚红分泌量影响的结果见表2，表2 中数据显示，除方4 组外，其他中药组和氯化铵组的气管酚红排泌量显著低于对照组(P＜0.05)，并且方7、方5 和氯化铵组小鼠的酚红排泌量显著低于其他处理组(P＜0.05)。表明，中药复方1～3、5～7 均有明显的化痰作用，方5、方7 的化痰作用更明显。

表2 中药复方对小鼠的化痰作用(±s，n=10)Tab.2 Expectorant effect of each Chinese medicine compound on the mice

注:同表1。Note:the same as table one.

组别Groups气管酚红的吸光度(546 nm 处)Tracheal phenol red absorbance气管酚红的排泌量/μg/mL Amount of tracheal phenol red excretion方1 组Group 10.2 ±0.02bc1.07 ±0.12bc方2 组Group 20.2 ±0.03bc0.89 ±0.08cd方3 组Group 30.17 ±0.02dc0.81 ±0.10d方4 组Group 40.28 ±0.02a1.59 ±0.06a方5 组Group 50.1 ±0.01e0.55 ±0.01e方6 组Group 60.2 ±0.03bc1.16 ±0.16b方7 组Group 70.1 ±0.01e0.53 ±0.01e氯化铵组Ammonium chloride group0.11 ±0.01e0.53 ±0.04e生理盐水组Physiological saline group0.25 ±0.02ab1.42 ±0.09 a

3 讨论

PRDC 的症状是咳嗽、咯痰、呼吸困难等，这些症状互为因果。积痰可引咳，可阻塞细支气管而致呼吸困难，进而造成继发或混合感染。咳嗽、咯痰若不加以控制，会使疾病进一步恶化。故对呼吸道疾病进行对症治疗，对防止疾病发展、并发症的发生和原发疾病的进一步恶化具有重要的意义。

中药的组方配伍是中兽医常用的治法，用不同药味进行配伍或相同药物、不同用量配伍成不同方剂是中药复方发挥不同疗效的“奥秘”，即中药配比是复方总体效应变化的核心，是复方功效的关键［4］。因此课题组对“清热解毒、宣肺利咽、化湿祛痰、益气养阴”类中药进行不同配伍，形成七个中药复方，进行止咳化痰的对比实验，以筛选、验证这些中药复方制剂的临床功效。

酚红祛痰实验利用酚红从气管排泄的特点，在化痰药的作用下，随着支气管分泌物的增加，由呼吸道黏膜排出的酚红量也增加，用分光光度计测出酚红的排泄量，就可得知药物化痰作用的强弱。本研究结果显示，方5、方7 能显著抑制小鼠氨水刺激诱发的咳嗽和明显促进小鼠气管酚红的排泌量，提示该两方可以作用于有关的化学器官，抑制支气管黏膜对刺激的反应性而表现出止咳作用;可通过增加呼吸道上皮的纤毛运动，促进支气管腺体的分泌，使痰液稀释、黏度下降，易于咳出而发挥化痰作用。

方5 中的山豆根、射干宣肺利咽化痰，清热解毒;瓜蒌、贝母具有清热解毒、宣肺利咽化痰之功;葶苈子、苏子降气止咳，利水祛痰。李国信等［5］的实验也表明射干提取物能明显增加小鼠气管酚红排泌量。研究表明贝母具有止咳化痰、抗菌、抗炎作用，通过多层次、多环节、多途径发挥综合调控效应，既能抑制致病因素，又能改善症状［6］。冯冰虹等［7］报道，桑白皮水煎剂氯仿萃取物对氨水所致小鼠咳嗽有镇咳作用，能明显延长小鼠咳嗽出现的潜伏期和减少2 min 内的咳嗽次数。进一步研究发现，桑白皮丙酮提取物有明显镇咳和祛痰作用［8］。五味子挥发油具有镇咳作用，五味子酸性成分具有祛痰作用，五味子多糖可显著提高巨噬细胞功能，促进淋巴细胞转化，具有较好的增强免疫作用。五味子粗多糖、五味子水煎剂具有升高白细胞及增强免疫功能的作用。现代医学常用于急慢性肺部疾病等都具有良好作用［9］。

方7 中石膏、知母、栀子、黄芩、大黄清泻肺火;知母、玄参具有凉血滋阴利咽;炙甘草益气止咳化痰。现代药理学研究表明，黄芩具有明显舒张支气管，改善气道痉挛作用［10］。赵铁华等［11］证实黄芩对金葡菌、肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌等有明显的抗菌活性。因此认为黄芩总黄酮可用于细菌引起的上呼吸道感染疾病的预防和治疗。玄参具有解热、抗菌、抗炎等药理作用。

因而综观方5、方7 全方，功补兼施，标本兼治，既能化痰止咳，又能宣肺利咽，提高免疫功能，故能延长小鼠的咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数，并能增加小鼠气管对酚红的排泌量，即有祛痰作用。但方5、方7 的配伍作用机制及其止咳化痰作用机制需做进一步的研究。

本次实验结果显示，方5、方7 对小鼠氨水引咳模型有明显的抑制作用，并能明显增加小鼠气管对酚红的排泌量，显示有较好的化痰作用，为其临床应用提供了科学的实验依据。

［1］白芳华，李新春.猪呼吸道疾病综合症及防控对策探讨［J］.榆林学院学报，2008，18(2):18－20.

［2］徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学(第3 版)［M］.北京:人民卫生出版社，2003:1359.

［3］徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学(第3 版)［M］.北京:人民卫生出版社，2003:1363.

［4］肖红斌，刘艳秋，王莉，等.基于成分相互作用的中药复方组分配伍研究［J］.世界科学技术—中医药现代化，2011，13(2):240.

［5］李国信，齐越，秦文艳，等.射干提取物止咳祛痰药理实验研究［J］.实用中医内科杂志，2008，22(2):3.

［6］孙涛.贝母止嗽颗粒治疗急性支气管炎的作用机理研究［D］.中国博士学位论文全文数据库(网络版)，2011，10，代号:E057－27.

［7］冯冰虹，赵宇红，黄建华.桑白皮的有效成分筛选及其药理学研究［J］.中药材，2004.27(3):204－205.

［8］冯冰虹，苏浩冲，杨俊杰.桑白皮丙酮提取物对呼吸系统的药理作用［J］.广东药学院学报，2005，21(1):47－49.

［9］崔洪，姚望，张丞.华中五味子中化学活性成分及药理作用研究进展［J］.河南科技大学学报(医学版)，2010，28(4):318－320.

［10］罗诚浩，宋旭艳，魏敏，等.黄芩苷与木犀草素混合物镇咳祛痰平喘作用的实验研究［J］.世界中西医结合杂志，2012，7(3):212.